袁吉锋教授团队开发自响应动态调控糖代谢策略实现非发酵型酿酒酵母

　　

酿酒酵母是重要的模式生物和工业微生物，但因其 Crabtree 效应，在有氧条件下也倾向酒精发酵，限制了其碳流量向目标产物的代谢通量转化。传统构建 Crabtree - 阴性非发酵型酵母的方法通常依赖静态控制糖酵解通量，比如通过敲除乙醇合成途径、补充乙酰辅酶A旁路途径、以及实验室适应性进化提高菌株生长速率，但是上述方法可能无法动态适应细胞在各种生物制造应用场景下的生理状态变化和代谢流量的变化，因此不能很好满足工业生产的需求。

近日，学院袁吉锋教授团队在Metabolic Engineering发表题为“Switching the yeast metabolism via manipulation of sugar phosphorylation”的研究论文，提出了动态调控糖利用速率实现非发酵型酿酒酵母的策略，并在新底盘酵母中开展了多种高附加值化合物的合成：

动态调控糖代谢实现非发酵型酵母：为了动态限制葡萄糖磷酸化相关酶基因表达，通过敲除HXK2和GLK1基因，并将 HXK1 置于严谨的葡萄糖抑制型 P_ADH2 启动子下，从而实现震荡式控制HXK1的表达量，从而构建出 Sc-CRAn 菌株。对比其与亲本菌株在生长、葡萄糖利用、乙醇生产、氧化还原辅因子等方面的差异，同时利用透射电镜观察线粒体增殖情况，我们发现改造后的Sc-CRAn菌株其符合Crabtree阴性特征：葡萄糖利用下降，乙醇副产物减少，与有氧呼吸相关的线粒体大幅度扩增（图1）。通过对Sc-CRAn菌株进行转录组测序、分析基因表达差异，发现众多代谢途径相关基因表达改变，表明细胞代谢流发生了全面重编程，以应对葡萄糖限流的类似“葡萄糖饥饿”的现象。进一步以半乳糖利用为模型，将GAL1置于发酵条件下严格抑制型启动子如P_ADH2或P_FBP1启动子下构建工程菌株，验证可以在半乳糖利用时同样实现类似的Crabtree效应弱化的代谢表型，从而证明动态调控糖磷酸化的策略在重编酵母初级代谢方面具有较好的普遍性。

图1 动态调控糖代谢实现非发酵型酿酒酵母

非发酵型酵母在生物合成方面的应用：本文进一步探索Crabtree弱化型酵母在非发酵化学合成中的应用，在支链氨基酸衍生中短链脂肪酸（SBCAs）合成方面，我们构建一条基于线粒体的SBCAs合成途径，发现非发酵型酵母可以有效提高SBCAs的产量，且副产物异丁醇明显减少，在摇瓶水平实现了在酿酒酵母中报道的最高SBCAs滴度（约770 mg/L）；在视黄醛合成方面，引入CrtYBIE-BCMO相关基因后，非发酵型酵母相比于对照菌株能够更有效积累视黄醛，并且产量比对照菌株得到了大幅度提升（图2）。上述结果表明，非发酵型酵母在醛类产物合成中具有独特优势，其产醇能力削弱与醛积累增强的特性为生物制造提供了新方向。

图2 非发酵型酵母在生物合成方面的应用潜力探索

本研究提出动态调控糖磷酸化的代谢工程新策略，深化了酵母代谢网络与Crabtree效应的机制解析，丰富了合成生物学在微生物代谢工程领域的研究内容；成功构建的 Crabtree - 弱化型酵母在 SBCAs 和视黄醛合成中展现出优势，为非发酵生物制造提供了有潜力的底盘菌株，有望推动相关化学品的工业化生产，在制药、食品等行业具有重要应用前景。

团队将进一步研究解决短链脂肪酸在酵母中生产的毒性问题，利用基因工程或代谢工程手段提高酵母对中短链脂肪酸的耐受性，优化生产工艺，实现更高产量和纯度的 SBCAs 生产。通过深入探究糖磷酸化调控酵母代谢的分子机制，有望挖掘更多潜在的调控靶点和网络，为精确设计和构建更高效的 Crabtree - 弱化型酵母菌株提供理论支持，拓展其在更多复杂天然产物合成中的应用。

本论文第一作者为博士后范聪、博士生范建、陈浩锋、林抒今、硕士生张丹丽（2023届）、宋婧雅（2024届），通讯作者为袁吉锋教授。本项目得到了国家重点研发计划项目（2024YFC3407000）、国家自然科学基金（32270087）、中央高校基本科研业务费（20720240120）的资助。

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717625000230

（文/图  袁吉锋教授课题组）