霍乱弧菌肠道定植与生物被膜形成的调控新机制：硝酸盐、微生物群与宿主易感性的关联

《mBio》：Carbon source, cell density, and the microbial community control inhibition of V. cholerae surface colonization by environmental nitrate

本文揭示霍乱弧菌（Vibrio cholerae）在肠道利用硝酸盐的机制，以及微生物群对其生物被膜形成和定植的影响。

　　

霍乱弧菌的 “肠道之旅”：探索其定植与生物被膜形成的奥秘

霍乱弧菌（Vibrio cholerae）是一种革兰氏阴性的兼性厌氧菌，它在肠道中引发的感染是一个复杂而微妙的过程，关乎着无数生命的健康。这种细菌可定植于人体回肠，引发急性且严重的腹泻疾病 —— 霍乱，严重威胁着人类的健康。在感染过程中，霍乱弧菌的生物被膜形成能力发挥着重要作用，其生物被膜由 Vibrio 多糖（VPS）依赖的结构和多种分泌性凝集素组成，这些成分共同构建起一个稳定的三维结构，帮助细菌附着在肠道表面，增强其在肠道内的定植能力。

在肠道这个独特的环境中，氧气和硝酸盐的分布呈现出明显的梯度变化。十二指肠的氧气分压较高，约为 60 mmHg，而到了回肠，氧气分压急剧下降至 10 mmHg 以下 。同时，硝酸盐在成年小鼠回肠中的浓度可接近 6 mM，在小肠其他区域则浓度较低。这些环境因素的差异对霍乱弧菌的生存和致病机制产生了深远的影响。霍乱弧菌在回肠的定植高度依赖有氧呼吸，它利用细胞色素 bd - 型泛醇氧化酶 I（bd-1）和血红素铜氧化酶 Cbb3 进行有氧呼吸，以维持自身的生长和代谢。然而，当氧气供应不足时，硝酸盐便成为了重要的电子受体。

硝酸盐呼吸与生物被膜形成的奇妙关联

研究发现，霍乱弧菌在有氧条件下利用硝酸盐进行呼吸的过程受到 cAMP 受体蛋白（CRP）的严格调控。CRP 是一种在碳代谢调控中发挥关键作用的转录因子，当环境中葡萄糖缺乏时，它会被激活。在摇瓶培养实验中，添加硝酸盐会显著抑制野生型霍乱弧菌的生物被膜积累，但对 Δcrp突变株的生物被膜形成却没有明显影响。这表明，CRP 在硝酸盐抑制霍乱弧菌生物被膜形成的过程中起着不可或缺的作用。进一步研究发现，这种抑制作用的关键在于硝酸盐被还原为亚硝酸盐，亚硝酸盐是直接抑制生物被膜积累的物质。在有氧培养条件下，野生型霍乱弧菌能够将硝酸盐转化为亚硝酸盐，从而抑制生物被膜的形成；而 Δcrp突变株由于缺乏 CRP 的调控，无法有效地将硝酸盐还原为亚硝酸盐，因此其生物被膜形成不受硝酸盐的抑制。

另一个重要的调控因子是 HapR，它在高细胞密度时发挥作用，是群体感应的主要调节因子。实验表明，ΔhapR突变株的生物被膜积累不受硝酸盐的影响，这意味着 HapR 在硝酸盐对生物被膜形成的抑制过程中也起着关键作用。研究人员推测，亚硝酸盐可能通过一种尚未明确的机制，依赖 HapR 来抑制霍乱弧菌的生物被膜形成。这种抑制作用可能发生在转录或转录后水平，目前虽然还不清楚具体的分子机制，但这一发现为深入理解霍乱弧菌的致病机制提供了重要线索。

探寻背后的分子机制：转录组学与基因调控的奥秘

为了深入探究硝酸盐抑制霍乱弧菌生物被膜形成的分子机制，研究人员进行了 RNA 测序（RNA-seq）实验。通过对野生型霍乱弧菌以及 Δcrp、ΔhapR和 ΔhapRΔcrp突变株在有无硝酸盐条件下的转录组分析，发现 CRP 在霍乱弧菌对硝酸盐的转录和转录后反应中起着核心作用，而 HapR 则在一定程度上减弱了这种转录反应。在所有测试的菌株中，只有少数基因在硝酸盐处理后呈现出共同的差异调节，基因本体（GO）分析显示，这些差异调节的基因主要参与有氧呼吸和铁转运过程，但与表面黏附无关。

有趣的是，研究人员发现硝酸盐不仅激活了与硝酸盐呼吸相关的基因转录，还激活了与有氧呼吸相关的基因转录。然而，这种激活作用只有在 CRP 存在的情况下才会发生。在 Δcrp突变株中，编码主要有氧末端氧化酶的bd-l和cbb3基因的转录水平在有无硝酸盐的情况下都显著降低。这表明，由于缺乏有效的有氧末端氧化酶，Δcrp突变株可能无法有效地消耗氧气，进而影响了硝酸盐的还原过程。

研究人员还对已知的生物被膜调控途径进行了深入研究。生物被膜的形成主要由两个转录因子 VpsR 和 VpsT 调控，它们通过结合第二信使环二鸟苷酸（c-di-GMP）来激活生物被膜合成基因的转录。但研究发现，硝酸盐抑制生物被膜积累的过程并非通过降低这些生物被膜合成基因的转录来实现。此外，虽然一些小 RNA（如ryhB和qrrX）参与了霍乱弧菌生物被膜的调控，但它们也不太可能是硝酸盐抑制生物被膜形成的主要原因。在众多差异调节的基因和非编码 RNA 中，研究人员发现了一个与生物被膜分散相关的基因cdgI，但它也不太可能是硝酸盐抑制生物被膜形成的关键因素，除非它通过一种全新的、不依赖 c-di-GMP 的机制发挥作用。

肠道微生物群的 “助力”：亚硝酸盐还原菌的神奇作用

在人体肠道这个庞大而复杂的生态系统中，微生物群的组成和功能对霍乱弧菌的感染过程有着重要影响。研究发现，一种名为Paracoccus aminovorans的肠道微生物与霍乱患者的微生物群密切相关。这种微生物能够将亚硝酸盐还原为氮气，从而减轻亚硝酸盐对霍乱弧菌生物被膜形成的抑制作用。当与霍乱弧菌共培养时，P. aminovorans能够消耗霍乱弧菌产生的亚硝酸盐，显著促进霍乱弧菌在有硝酸盐存在的情况下的生物被膜积累。这一发现揭示了肠道微生物群在调节霍乱弧菌肠道定植中的重要作用，为理解霍乱的发病机制提供了新的视角。

进一步研究发现，P. aminovorans对霍乱弧菌生物被膜形成的促进作用具有特异性。它自身形成的生物被膜量很少，并且对 Δvps突变株的表面黏附没有明显影响，这表明它主要是通过代谢亚硝酸盐来促进 VPS 依赖的生物被膜形成，而不是为霍乱弧菌提供另一种表面黏附方式。此外，P. aminovorans还能显著改善 Δcrp突变株的生长，这暗示它可能分泌了某种未被鉴定的代谢产物，能够被 Δcrp突变株利用。

未解之谜与未来展望：深入探索霍乱弧菌的致病机制

尽管在霍乱弧菌的研究方面取得了重要进展，但仍有许多未解之谜等待着科学家们去探索。例如，CRP 激活硝酸盐还原的具体机制尚不明确，虽然已经排除了对narQ和nap基因转录激活的可能性，但 CRP 究竟如何在有氧培养条件下促进硝酸盐还原，仍然是一个悬而未决的问题。有研究推测，FNR 和 ArcAB 等转录因子可能参与其中，它们对氧气可用性的响应可能影响了硝酸盐还原过程，但这还需要进一步的实验验证。

亚硝酸盐抑制霍乱弧菌 VPS 依赖的生物被膜形成的机制以及 ΔhapR突变株对亚硝酸盐抗性的基础也有待揭示。虽然已经知道这种抑制作用与 HapR 有关，但具体的分子机制仍然不清楚。此外，在硝酸盐补充的霍乱弧菌培养物中，铁清除基因转录增加的原因也尚未明确，这可能涉及到 Fur、FNR 和 ArcA 等多个调控因子的复杂相互作用，需要更深入的研究来解析。

未来的研究可以进一步深入探究这些未解之谜，通过更深入的分子生物学研究、遗传学实验以及对肠道微生物群的进一步分析，有望揭示霍乱弧菌在肠道定植和致病过程中的更多奥秘。这不仅有助于我们更深入地理解霍乱的发病机制，还可能为开发新的治疗策略和预防措施提供理论依据，从而更好地应对霍乱这一严重威胁人类健康的疾病。