构建光合固氮体系的关键进展：确定最小功能基因集

《mBio》：Investigation of the Cyanothece nitrogenase cluster in Synechocystis: a blueprint for engineering nitrogen-fixing photoautotrophs

本文通过重构固氮酶（nif）基因操纵子，明确了非结构基因的重要性，为合成固氮系统奠定基础。

　　

在生命科学的研究领域中，氮元素对于生物体的生长和发育至关重要。而将大气中的氮气转化为生物可利用的氮源，是许多生物实现生长繁衍的关键环节。其中，单细胞固氮蓝藻的固氮酶（nif）基因簇，在与真核光合生物形成固氮伙伴关系方面具有独特优势，这引起了科研人员的浓厚兴趣。

研究背景

自然界中存在着许多有趣的共生现象，多个自然内共生事件表明，单细胞蓝藻目（Chroococcales）的固氮酶基因簇常常被真核光合生物选择，用于建立光合 - 固氮伙伴关系。在这些蓝藻中，Cyanothece 的 nif 基因簇表现尤为突出，它能与硅藻（如 Rhopalodia、Epithemia 和 Climacodium）以及球石藻（Braarudosphaera bigelowii）等形成共生关系。这些自然发生的实例暗示着 Cyanothece nif 基因簇具备一些特殊的特征，使其能够在光合自养生物中发挥固氮作用，这为研究人员探索合成氮和碳固定系统提供了重要线索。

此前，研究人员已成功将 Cyanothece sp. ATCC 51142 的固氮酶基因簇导入单细胞非固氮蓝藻 Synechocystis sp. PCC 6803（以下简称 Synechocystis 6803）中，使该菌株获得了显著的固氮能力，这一成果为后续更深入的研究奠定了基础。然而，对于 Cyanothece nif 基因簇中除结构基因 nifHDK 外，其他基因在固氮过程中的必要性，以及如何构建一个高效的合成固氮系统，仍有待进一步探索。

研究方法

为了深入了解固氮酶基因簇的功能，研究人员采用了一系列巧妙的实验方法。他们运用自下而上的策略，对来自 Cyanothece 51142 的 nif 基因进行重新组织，构建新的操纵子。具体来说，研究人员选取了 Synechocystis 6803 的天然遗传元件，包括启动子、核糖体结合位点（RBS）和转录终止子，将这些元件与 nif 基因进行组合，构建出不同的表达盒，并将其插入穿梭载体 pCB - SC101 的骨干中。

在研究过程中，为了精确确定每个基因在固氮过程中的作用，研究人员利用 CRISPR/cpf1 策略，对重构的 nif 操纵子中的基因进行逐个删除，通过观察固氮酶活性的变化，来判断基因的必要性。此外，研究人员还对不同的启动子进行测试，以探究其对 nif 基因表达强度的影响，进而了解表达强度与固氮酶活性之间的关系。

研究结果

1. 结构基因表达水平对固氮酶活性的影响：在 Cyanothece 51142 的 nif 基因簇中，nifHDK 操纵子的表达由 nifH 基因前的序列驱动。研究人员通过将 nifU 和 nifH 之间的序列克隆到含有不同启动子的盒中，测试了不同启动子对基因表达强度的影响。实验结果显示，与天然启动子 P_nifH相比，P_sll0452和 P_sll1626等较强的启动子能够增强固氮酶活性，而最强的启动子 P_trc1O驱动 nifHDK 表达时，固氮酶活性却出现了超过 50% 的下降。这表明，结构 nif 基因的最佳表达对于实现高固氮酶活性至关重要，这一发现与之前对 Klebsiella 的研究结果相吻合。
2. 重构固氮酶基因操纵子：研究人员对 Cyanothece 51142 的 nif 基因簇中的 24 个基因进行分析，其中 16 个基因在 JGI/IMG 微生物数据库中被注释为 nif 基因。他们将这 16 个基因依次组织成五个独立的操纵子，即 nifHDK、nifBSU、nifEN、nifPVZT 和 nifXWhesAB，并通过转化 Synechocystis 6803，获得了五个工程菌株（RC1 至 RC5）。实验结果表明，含有 12 个基因（nifHDKBSUENPVZT）的菌株 RC4 表现出显著的固氮活性，而补充了 nifXWhesAB 操纵子的 RC5 菌株，其固氮活性更是提高了 60 倍，这进一步证实了这些基因是固氮机制的重要组成部分。
3. ferredoxin 对固氮酶活性的影响：ferredoxin 作为固氮酶 Fe 蛋白的直接电子供体，对固氮酶活性有着重要影响。在 Cyanothece 51142 的 nif 基因簇中，有一个注释为 fdxN 的 ferredoxin 基因，在其 35 - 基因的扩展簇中还有 fdxH 和 fdxB 两个 ferredoxin 基因。研究人员将这三个 ferredoxin 基因分别导入 RC5 菌株中，并使用四个不同的启动子（P_slr0701、P_ssr2227、P_psbA2和 P_trc1O）驱动其表达。实验发现，不同的 ferredoxin 对固氮酶活性的影响各不相同。当 P_psbA2启动子驱动的 fdxN 基因导入 RC5 时，固氮酶活性提高了 50%；而当强启动子驱动的 fdxB 基因导入时，固氮酶活性显著降低；有趣的是，无论使用何种启动子，导入 fdxH 基因都会导致固氮酶活性下降 60%，这表明 fdxH 基因产物对固氮作用可能存在负面影响。
4. 确定固氮酶活性的关键 nif 基因：在菌株 RC5 的 16 个注释基因中，除了结构基因 nifHDK 外，其他 13 个基因在固氮过程中的作用尚不明确。研究人员利用 CRISPR/cpf1 策略，对这 13 个基因进行逐个删除，构建了 13 个基于 RC5 的突变菌株。实验结果显示，删除 nifB、nifE 或 nifN 基因会导致固氮酶活性完全丧失，这是因为这些基因是 M 簇生物合成所必需的，在所有固氮生物中高度保守。此外，删除 nifSU 和 nifV 等基因也会导致固氮酶活性大幅下降，其中 nifSU 蛋白参与铁硫簇的合成，nifV 编码的同柠檬酸合酶是二氮酶催化中心 M 簇的组成部分。同时，研究还发现，nifP、nifZTW、nifX 以及 hesAB 等基因在固氮过程中也发挥着重要作用，删除这些基因会不同程度地降低固氮酶活性。

研究讨论

Cyanothece 属的蓝藻拥有已知最大的 nif 基因簇之一，它们与高等光合自养生物形成固氮伙伴关系的现象表明，其 nif 基因簇可能具有独特的优势。研究人员通过将 Cyanothece 51142 的 nif 基因簇导入 Synechocystis 6803，成功构建了具有固氮能力的工程菌株，虽然该菌株的固氮活性与 Cyanothece 51142 相比仍有差距，但相较于表达其他蓝藻 nif 基因的 Synechocystis 6803 菌株，其固氮活性有了显著提高，这为设计合成太阳能驱动的固氮系统提供了有力的支持。

在电子传递方面，研究发现尽管在 RC5 菌株中没有导入 Cyanothece 51142 的 ferredoxin 基因，但该菌株仍能进行固氮，这表明 Synechocystis 6803 的内源性 ferredoxin 能够识别引入的固氮酶 Fe 蛋白，并作为电子桥参与固氮过程。进一步研究发现，只有 fdxN 基因在高表达时对固氮酶活性有积极影响，而 fdxH 和 fdxB 则对固氮酶活性产生负面影响，这可能与细胞内的氧动力学差异有关。

然而，目前对于在有氧条件下实现强大而高效固氮所需的完整细胞机制，仍然知之甚少。最近，转座子测序（Tn - Seq）策略已被用于各种非固氮物种，包括蓝藻，以识别特殊条件下的必需基因集。未来，将此类研究扩展到固氮蓝藻菌株，有望揭示实现高水平固氮所需的整个细胞机制，为进一步优化合成固氮系统提供更深入的理论依据。

综上所述，本研究通过对 Cyanothece 51142 的 nif 基因簇进行深入分析，确定了在非固氮光合自养生物中实现最佳固氮酶功能所需的最小基因集，为构建合成光合固氮系统提供了重要的理论基础和实践指导，推动了生命科学领域在固氮研究方面的进展。