空肠弯曲菌在母乳环境中的生存策略：突破防线的进化奥秘

《mBio》：Campylobacter jejuni resistance to human milk involves the acyl carrier protein AcpP

本文研究发现空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）可通过细胞膜改变抵抗母乳抗菌性，揭示其在母乳喂养婴儿肠道生存机制。

　　

在全球范围内，空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）是一种常见的食源性病原体，在中低收入国家（LMICs），它对婴儿的健康构成了严重威胁，与较高的发病率和死亡率相关。通常来说，母乳是婴儿重要的营养来源，其中含有的抗菌成分能帮助婴儿抵御感染。然而，令人困惑的是，研究发现，在 LMICs 地区，母乳喂养的婴儿腹泻粪便样本中，空肠弯曲菌的水平明显高于非母乳喂养的婴儿。这一现象引发了科学界的关注，促使研究人员深入探索空肠弯曲菌在母乳环境中的生存策略。

空肠弯曲菌与母乳喂养的现状

空肠弯曲菌是美国细菌性食源性疾病的最常见病因，在全球范围内，它也是从细菌性腹泻患者中分离出的主要肠道病原体之一。在 LMICs 地区，婴儿受空肠弯曲菌感染的情况尤为严重，高达 85% 的儿童在 1 岁时粪便中可检测出空肠弯曲菌。而且，感染后的并发症如环境性肠功能障碍（EED）、格林 - 巴利综合征（GBS）、反应性关节炎和肠易激综合征等也在不断增加。EED 会导致营养吸收不良、肠道损伤、生长迟缓、口服疫苗反应降低、认知发育受损以及代谢综合征和心血管疾病风险增加。

母乳喂养一直被认为对降低空肠弯曲菌感染风险具有重要作用。母乳不仅为婴儿提供营养，还能帮助婴儿肠道微生物群、免疫系统、大脑和消化系统的发育，其中的抗菌成分更是能有效抵御传染病。这些抗菌成分包括溶菌酶，它可以水解革兰氏阳性微生物中暴露的肽聚糖链中的重复糖单元；乳铁蛋白，能从病原体中螯合铁并结合革兰氏阴性微生物的细菌脂多糖（LPS）；还有抗体、寡糖、脂肪和抗菌肽（AMPs），如人源抗菌肽（LL - 37）等。此外，母乳中的一些脂质在宿主或牛奶共生微生物的脂肪酶作用下，可转化为具有抗菌活性的脂肪酸（FAs）和单甘油酯。

近期的研究还聚焦于母乳寡糖（HMOs）对空肠弯曲菌定植和感染的影响。HMOs 和抗体可以阻止细菌附着在宿主表面，抗体还能引发免疫细胞的吞噬作用。不同结构的 HMOs 在母乳中含量丰富，其浓度在初乳中可达 20 - 25g/L，随着母乳成熟，浓度会降至 5 - 20g/L。研究发现，岩藻糖基化的 HMOs 可以作为病原体的诱饵，保护婴儿免受感染，例如 2′ - 岩藻糖基乳糖能在体外和体内抑制空肠弯曲菌的入侵。同时，许多肠道共生菌能消化 HMOs 并释放岩藻糖，超过 60% 的空肠弯曲菌分离株可以代谢 L - 岩藻糖，并向其趋化。然而，基因组学研究却发现，在撒哈拉以南非洲和南亚的七个地区，纯母乳喂养的婴儿粪便中空肠弯曲菌的丰度明显高于非母乳喂养的婴儿，且母乳喂养的婴儿主要被非 L - 岩藻糖代谢的空肠弯曲菌菌株定植。这表明空肠弯曲菌可能存在独特的策略来抵抗母乳的抗菌作用，在母乳喂养婴儿的肠道中生存繁衍。

空肠弯曲菌在母乳中的生长及基因表达变化

研究人员尝试在 100% 母乳中培养空肠弯曲菌 11168 和 81 - 176 菌株，其中 11168 代表能代谢岩藻糖的菌株，81 - 176 代表不能代谢岩藻糖的菌株。经过 24 小时的培养，通过荧光显微镜观察 4′,6 - 二脒基 - 2 - 苯基吲哚染色的细胞，并进行菌落计数。结果发现，这两种菌株在 Mueller - Hinton（MH）肉汤中生长良好，菌落数量显著增加；但在母乳中，虽然 24 小时后观察到的细胞数量比 0 小时略有增加，但菌落计数却大幅下降。这表明空肠弯曲菌在母乳中只能进行有限的细胞分裂，最终会被母乳杀死。

为了探究母乳对空肠弯曲菌基因表达的影响，研究人员将空肠弯曲菌 11168 和 81 - 176 与母乳孵育 15 分钟后，分析其转录组，并与在 MH 肉汤中生长的菌株进行比较。转录组分析结果显示，核糖体蛋白的表达水平最高，这通常是衡量生长和代谢活性的指标，同时，两种菌株都上调了多种氨基酸的利用途径，表明空肠弯曲菌将母乳视为适合生长的培养基。此外，由于母乳中铁含量有限，且存在乳铁蛋白，空肠弯曲菌还上调了铁获取相关的外膜受体、转运蛋白以及能量转导系统。然而，尽管空肠弯曲菌为在母乳中生长做了这些准备，但生存研究表明它们无法在母乳中长期存活，这进一步证实了母乳中含有能杀死空肠弯曲菌的抗菌成分。

空肠弯曲菌在母乳中的进化及相关机制

在发现空肠弯曲菌在母乳中的生长受限后，研究人员进行了进化实验。他们在 MH 肉汤中逐步增加母乳浓度，对空肠弯曲菌 11168 和 81 - 176 进行传代培养。经过 100 多次传代后，进化后的菌株 11168E 和 81 - 176E 能够在含有较高浓度母乳的 MH 肉汤中生长，分别可耐受高达 57% 和 60% 的母乳。随后，在其他捐赠者的母乳中进行生长试验，也证实了进化菌株的生长能力明显优于亲本菌株。

为了确定母乳中抑制空肠弯曲菌生长的成分，研究人员进行了一系列实验。他们发现，去除脂肪成分的母乳无法支持野生型菌株生长，而经过蛋白酶 K 消化后的母乳，能使野生型菌株生长明显改善。添加酪蛋白氨基酸的实验表明，蛋白酶 K 消化后释放的游离氨基酸并非促进菌株生长的原因，这说明母乳中的蛋白质成分是抑制空肠弯曲菌生长的主要因素，其中可能含有抗菌肽和 / 或蛋白质。

对进化菌株和亲本菌株进行全基因组测序后发现，两种进化菌株在多个基因上发生了突变，其中包括编码主要外膜孔蛋白（PorA）和初级酰基载体蛋白（AcpP）的基因。PorA 的氨基酸变化可能影响营养物质的进入和抗菌化合物的排出，而 AcpP 作为脂肪酸合成中的辅酶，对细菌细胞膜的脂肪酸组成和膜功能有重要影响。为了研究这些变化对空肠弯曲菌在母乳中生长的重要性，研究人员构建了多个acpP和porA点突变体，并对其生长曲线进行分析。结果发现，acpP突变体（如 81 - 176ΔacpP^A34P和 11168ΔacpP^G33R）在母乳中的生长明显改善，而porA突变体的生长没有显著变化，这表明 AcpP 突变在空肠弯曲菌抵抗母乳抗菌作用中起主要作用。

空肠弯曲菌进化后的细胞膜变化

为了探究空肠弯曲菌进化后细胞膜的变化，研究人员利用透射电子显微镜（TEM）对 81 - 176 野生型（WT）、进化型（81 - 176E）和突变体（81 - 176ΔacpP^A34P、81 - 176ΔporA^D142H）进行了观察。结果显示，81 - 176WT 呈现典型的螺旋形形态，细胞膜光滑；而 81 - 176E、81 - 176ΔacpP^A34P和 81 - 176ΔporA^D142H则表现出不规则的外膜。其中，81 - 176ΔacpP^A34P细胞周围有一层连续的小外膜囊泡，81 - 176ΔporA^D142H有大的膜泡从细胞突出，这些形态变化表明进化菌株的细胞膜组成发生了改变。

进一步对脂寡糖（LOS）和磷脂的脂质组成进行分析。通过脱氧胆酸（DOC） - PAGE 分析 LOS，发现野生型和acpP突变体之间 LOS 的电泳迁移率没有明显变化，说明 LOS 寡糖没有重大改变。但对脂质 A 的酰化谱进行基质辅助激光解吸 / 电离飞行时间质谱（MALDI TOF - MS）分析，以及对脂肪酸进行气相色谱 - 质谱（GC - MS）分析后发现，11168ΔacpP^G33R的脂质 A 中含有更多短链脂肪酸的单磷酸和双磷酸己酰成分，而 81 - 176 和 81 - 176ΔacpP^A34P主要表达单磷酸化脂质 A，且两者之间没有观察到酰基链长度的变化。在磷脂分析中，81 - 176E 和 81 - 176ΔacpP^A34P与野生型相比，有较长和不饱和酰基链的磷脂酰甘油（PG）显著增加，较短酰基链的 PG 相应减少，同时磷脂酰乙醇胺（PE）30:0 和 32:0 显著减少，溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）16:1、16:0 和 18:1 显著增加，所有检测到的脂肪酸水平也有所增加。这些结果表明，空肠弯曲菌进化后，细胞膜的脂质组成发生了显著变化，为进一步研究其与母乳抗性的关系提供了线索。

空肠弯曲菌细胞膜变化的功能影响

细胞膜结构和组成的变化可能为空肠弯曲菌带来一些优势。研究人员通过多种实验来探究这些变化的功能影响。

多粘菌素 B 是一种针对细胞膜的阳离子洗涤剂抗生素，它通过结合脂质 A 并插入细胞膜来发挥作用。实验结果表明，两种进化菌株在含有多粘菌素 B 的培养基上生长明显优于野生型，其中 11168ΔacpP^G33R对多粘菌素的抗性显著增加，而 81 - 176ΔacpP^A34P的敏感性没有变化。这与 11168ΔacpP^G33R脂质 A 组成的变化一致，说明细胞膜变化影响了空肠弯曲菌对多粘菌素 B 的抗性。

空肠弯曲菌噬菌体 NCTC 12673 是一种能杀死 11168 菌株的裂解性 T4 样肌病毒。研究人员通过噬菌体平板实验发现，11168E 和 11168ΔacpP^G33R对 NCTC 12673 感染的抗性明显高于野生型。已知该噬菌体的主要受体是荚膜多糖（CPS），目前推测周围的膜泡可能作为诱饵捕获注入的噬菌体 DNA，导致感染失败，但还需要进一步研究来证实。

此外，基因组测序发现两种进化菌株的porA基因发生了核苷酸变化，导致 D142 氨基酸改变。这个氨基酸残基负责在孔道的收缩区结合 Ca^{2 +}，对防止抗菌药物如环丙沙星通过孔道起重要作用。实验表明，只有携带 PorA D142 突变的菌株（如 11168E 和 81 - 176 的相关突变体）对环丙沙星的敏感性增加，而acpP突变不影响环丙沙星敏感性。这说明 PorA 的突变主要影响空肠弯曲菌对环丙沙星的敏感性，而在抵抗母乳抗菌作用方面可能作用较小。

研究结论与展望

本研究通过分析空肠弯曲菌暴露于母乳后的基因表达变化、进化出能在母乳中生长的菌株以及研究相关突变的作用，深入探讨了空肠弯曲菌抵抗母乳抗菌活性的机制。研究发现，AcpP 的特定氨基酸变化对空肠弯曲菌在母乳中的生长至关重要，这些变化可能通过影响与脂质 A 和磷脂生物合成相关的蛋白质相互作用，改变细胞膜的脂质组成。细胞膜的变化不仅使空肠弯曲菌能够在母乳中生存，还影响了其对抗生素的敏感性和对噬菌体感染的抵抗力。

然而，目前仍有许多问题有待解决。例如，虽然确定了蛋白质成分是抑制空肠弯曲菌生长的主要因素，但具体是哪些蛋白质或抗菌肽发挥作用还不清楚，需要进一步对母乳进行分离和鉴定。此外，本研究是在体外进行的，肠道环境更为复杂，婴儿与肠道微生物群的相互作用也会影响空肠弯曲菌的定植和生存。未来的研究可以利用体内模型，如小鼠模型模拟婴儿 EED，来进一步研究空肠弯曲菌的关键突变体在体内的定植能力，以及母乳对其肠道定植的影响。这些研究将有助于深入了解空肠弯曲菌在母乳喂养婴儿肠道中的生存机制，为预防和治疗空肠弯曲菌感染提供新的思路和方法。