一种新型转座子衍生小 RNA 调控细菌抗生素耐受性的研究进展

本文发现一种新型转座子衍生 sRNA（stnpA）可调节细菌对磷霉素的耐受性，为抗菌治疗提供新靶点。

　　

引言

在细菌的世界里，质粒作为自我复制的染色体外元件，发挥着至关重要的作用。它能携带并传播基因，赋予细菌诸如耐药性、致病性、代谢特殊物质的能力以及在恶劣环境中生存的本领。其中，结合性质粒在病原菌的进化过程中扮演着关键角色，它可在不同物种间进行水平转移，成为多药耐药菌出现的主要途径之一。

转座子（Tn）的可控重组活动也与耐药菌的发展紧密相关。在众多转座子家族里，属于 Tn3 家族的 Tn2 是抗生素耐药质粒中最为常见的变体。值得注意的是，在一些细菌的结合性质粒上，常能发现截短形式的 TnpA 蛋白，这些蛋白缺失了 DD (E/D) 催化结构域，失去了转座活性。不过，近期研究发现，这些截短的转座子可通过引入新的调控序列、多聚腺苷酸化信号等方式，对宿主基因表达产生重要影响，还能参与转录后调控。

小 RNA（sRNA）在细菌中通常是短小的非编码分子，它们位于基因组或可移动及辅助元件内，通过与 RNA 配对或与蛋白质形成复合物，来调节靶基因的表达，进而影响 mRNA 的稳定性和翻译过程，或者改变蛋白质的活性。sRNA 常常在特定条件或环境压力下表达，帮助细菌对各种生理功能做出快速响应，比如应对压力、运动、生物膜形成以及代谢过程等。在革兰氏阳性菌中，sRNA 还参与调控群体感应和毒力因子相关基因，凸显了其在致病过程中的重要性。

近年来，抗生素治疗失败的比率不断攀升，这引发了人们对细菌抗生素耐受性（antibiotic persistence）现象的深入研究。抗生素耐受性指的是一小部分细菌能够在高浓度抗生素环境下存活的能力，这种现象与细菌的应激信号通路密切相关，像细菌生物膜、恶劣的宿主环境以及亚致死浓度抗生素的暴露等，都能促使耐受性细菌的形成。然而，目前对于耐受性细菌形成、存活和复苏的分子机制，人们还尚未完全了解。

在革兰氏阴性菌中，抗生素积累是细菌产生耐受性的关键因素，而细胞膜通透性和外排活性则是决定细胞内抗生素积累水平的两个重要因素。磷霉素是一种常用于治疗急性尿路感染的抗生素，它能进入细菌细胞质，通过靶向 MurA 酶来阻碍肽聚糖的生物合成。目前已知，磷霉素可通过 l -α - 甘油磷酸和己糖 - 6 - 磷酸转运系统（GlpT 和 UhpT）进入细胞，此外，外膜孔蛋白 OmpF、OprP 和 OprO 也能促进其跨膜运输。细菌拥有五大主要的膜转运蛋白超家族，其中 ATP 结合盒超家族（ABC）在各个生命领域都起着重要作用，它能以 ATP 依赖的方式运输多种物质，包括抗生素、脂质和蛋白质等。YadG 是一种假定的 ABC 转运蛋白的 ATP 结合蛋白，属于 III 型转运蛋白，具有抗生素外排和致病相关的功能。

在本研究中，科研人员发现并鉴定了一种质粒编码的 sRNA（stnpA），它能够调节细菌对磷霉素的耐受性。这种 sRNA 源自 Tn3 家族转座子转座酶的 3' 端，位于流行的多药耐药质粒 pNDM - HN380 上，并且在磷霉素处理后会表达。stnpA sRNA 可直接与 YadG 蛋白结合，调节细胞内磷霉素的积累，从而使细菌对磷霉素产生耐受性。此前，sRNA 在细菌耐受性方面的作用鲜有报道，而该研究首次揭示了多药耐药质粒编码的 sRNA 对细菌抗生素耐受性的调控作用，为细菌耐药机制的研究开辟了新的方向。

材料和方法

1. 细菌菌株、质粒和生长条件：研究中使用了多种大肠杆菌（Escherichia coli）菌株，如 DH5α 用于常规克隆和质粒繁殖，BL21 (DE3) 用于重组蛋白表达，J53 用于探究 stnpA 的功能和作用机制，UPEC CFT073 则用于评估 stnpA 对致病性大肠杆菌毒力和发病机制的影响。通过 λ red 重组技术构建突变菌株和突变质粒，并利用菌落 PCR 和 Sanger 测序进行验证。质粒构建时，以 J53 和 pNDM - HN380 的基因组 DNA 为模板扩增目标序列，然后将其插入到所需载体中。所有菌株在溶原肉汤（LB）培养基或 LB 琼脂平板上，于 37°C 有氧条件下培养，根据实验需求添加抗生素和诱导剂。
2. RNA 提取：用于 Northern blot 和 cDNA 末端快速扩增（RACE）的 RNA，采用 TRIzol 试剂提取。具体步骤为：收集 50 mL OD₆₀₀为 0.6 - 0.8 的细菌细胞，重悬于 1 mL TRIzol 中，60°C 孵育 10 分钟，离心后收集上清，与 200 mL 氯仿剧烈混合，静置 5 分钟，再次离心，取上层水相与 1 mL 异丙醇混合，于 - 80°C 过夜沉淀 RNA。通过离心收集 RNA 沉淀，用 70% 冰乙醇洗涤两次，风干后溶于 80 μL 无核酸酶水中。为去除残留 DNA，加入 TURBO DNase 于 37°C 孵育 75 分钟，然后重复 TRIzol - 氯仿提取过程。最后，使用 NanoDrop One/Onc^C UV - Vis 分光光度计测定总 RNA 浓度。对于 RNA 水平分析，如电泳迁移率变动分析、RNA 下拉实验和逆转录定量聚合酶链反应，采用 Qiagen RNeasy Mini 试剂盒提取总 RNA，并按照试剂盒说明进行柱上 DNase 消化。通过琼脂糖凝胶电泳评估总 RNA 的完整性，并用 NanoDrop One/Onc^C UV - Vis 分光光度计进行定量。
3. Northern blot：进行 Northern blot 实验时，将 60 μg 总 RNA 在 Gel Loading Buffer II 中 70°C 变性 10 分钟，然后加载到 6% 尿素变性聚丙烯酰胺凝胶上。RNA 转移到 Hybond - XL 膜后，在 120 mJ/cm²的紫外光下交联 2 分钟。用 T4 多核苷酸激酶将针对 stnpA 的体外转录 RNA 探针进行放射性标记，再通过 Centri - Spin column - 20 纯化。膜在 UltraHyb 缓冲液中预杂交后，与探针在 42°C 杂交过夜，随后用 20 mL 0.2× 柠檬酸钠缓冲液（SSC）和 0.1% SDS 洗涤两次，每次 10 分钟。最后，将膜暴露于磷光屏过夜，并用 PhosphorImager 成像。
4. RACE：5' 和 3' RACE 实验使用 FirstChoice RLM - RACE Kit 按照说明书进行。5' RACE 时，先将 10 μg TRIzol 提取的总 RNA 用烟草碱性磷酸酶（TAP）处理 1 小时，然后用 T4 RNA 连接酶将 5' RACE 适配器连接到 RNA 上。以连接后的 RNA 为模板，用 M - MLV 逆转录酶和随机六聚体引物合成 cDNA，再进行巢式 PCR。3' RACE 时，4 μg TRIzol 提取的总 RNA 先用大肠杆菌多聚（A）聚合酶添加多聚（A）尾，然后用 3' RACE 适配器和 M - MLV 逆转录酶合成 cDNA，同样进行巢式 PCR。最后将 PCR 产物克隆到 pGEM - T Easy 载体中并测序。
5. 蛋白质纯化：将带有 N 端 His 6 - 标签的蛋白质对应的 DNA 片段插入 pET28a 质粒，转化到 BL21 (DE3) 化学感受态细胞中。细菌在 LB 培养基中培养至 OD₆₀₀约为 0.6 时，用 1 mM 异丙基 - β - D - 硫代半乳糖苷（IPTG）诱导，16°C 继续培养 18 小时后离心收集细胞。将细胞沉淀重悬于裂解缓冲液中，加入溶菌酶，超声裂解细胞。离心后取上清，加载到 Ni - NTA 柱上，经过洗涤后用洗脱缓冲液洗脱蛋白质，再通过 Amicon 超滤离心过滤器进行缓冲液交换和浓缩。使用 SDS - PAGE 分析蛋白质纯度，采用 Bradford 法测定蛋白质浓度。
6. Western blot：将纯化的蛋白质样品在 10% 变性十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS - PAGE）凝胶上分离，然后转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。膜用 3% 牛血清白蛋白（BSA）在 TBST（含 0.1% Tween - 20 的 Tris 缓冲盐水）中室温封闭 1 小时，再与抗 His 标签一抗在 4°C 孵育过夜。洗涤后，与 HRP 标记的二抗室温孵育 1 小时，最后用化学发光底物孵育并成像。
7. 耐受性实验：将过夜培养的细菌以 1:100 的比例稀释到含有适当抗生素的新鲜 LB 培养基中，37°C 振荡培养约 3 小时至对数生长期。对于蛋白质过表达菌株，将对数生长期的培养物分为两组，一组用 IPTG（1 mM）诱导 2 小时，另一组作为对照。然后将细菌暴露于终浓度为 100 μg/mL 的磷霉素中，通过系列稀释和平板计数法测定菌落形成单位（CFU），计算细胞存活率。
8. RNA 下拉实验：通过 PCR 扩增从 pNDM - HN380 质粒获得带有 T7 启动子的 stnpA 正义和反义 RNA 模板，纯化后体外转录并标记生物素。将纯化的生物素化 RNA 与链霉亲和素磁珠孵育，再加入细菌裂解液进行孵育。洗涤后，通过煮沸磁珠洗脱结合的蛋白质，用银染或质谱鉴定。
9. 逆转录 - 定量聚合酶链反应（RT - qPCR）：取 1 μg RNA，使用 PrimeScript First - Strand cDNA Synthesis Kit 合成 cDNA，稀释 10 倍后，在 QuantStudio 5 实时 PCR 系统上进行实时 PCR 分析。每个实验至少进行三个生物学重复，每个重复进行三个技术重复，以 gapA 基因为内参，采用 2^?ΔΔCt法计算基因表达的相对变化。
10. 启动子研究：扩增 stnpA 转录起始位点上游 290 bp 的区域，克隆到无启动子的生物发光报告质粒 pQH5 中构建 pQH5 - stnpA。通过 PCR 定点突变技术在 stnpA 启动子的预测 - 10 和 - 35 核心启动元件中引入点突变，将质粒转化到 CFT073 中，用微孔板读数仪测量细胞生物发光和 OD₆₀₀，以生物发光读数与 OD₆₀₀的比值表示启动子活性。
11. 细菌三杂交（B3H）实验：B3H 实验用于检测体内 RNA - 蛋白质相互作用。将携带 lacZ 报告基因的大肠杆菌 HP16 菌株分别转化三种质粒：一种组成型表达融合蛋白的质粒 p35u4，该融合蛋白包含 DNA 结合蛋白 λCI 和噬菌体 MS2 的 RNA 结合外壳蛋白；一种表达目的蛋白 YadG 的质粒 pBRα - yadG；一种表达含有 MS2 发夹结构和 stnpA 的杂交 RNA 的质粒 pCH1 - stnpA，以反义 stnpA 构建体作为阴性对照。培养细菌至对数中期后，通过液体 β - 半乳糖苷酶（β - gal）活性测定或平板显色实验来评估 RNA - 蛋白质相互作用。
12. 电泳迁移率变动分析（EMSA）：体外转录 stnpA RNA 并进行凝胶纯化，与 5' 荧光素（FAM）标记的 SP6 DNA 引物退火。将不同浓度的纯化重组蛋白 YadG 与 FAM 标记的 stnpA 在结合缓冲液中孵育，然后进行 6% 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，用 Typhoon 8600 成像仪分析图像，通过 ImageJ 软件进行密度测定，并使用 GraphPad Prism 9.0.2 基于单点特异性结合进行非线性回归分析，计算结合 RNA 的比例。
13. 细胞内磷霉素积累定量：参考先前的方法并进行部分修改来测定细菌细胞内磷霉素的积累。将过夜培养的细菌接种到新鲜 LB 培养基中培养至对数中期，加入磷霉素孵育后，洗涤去除细胞外磷霉素。通过超声裂解细胞，离心过滤去除细胞碎片和蛋白质，采用液相色谱 - 串联质谱（LC - MS/MS）测定上清液中磷霉素的含量，根据公式计算细胞内磷霉素的积累量。

结果

1. ESBL 质粒编码的小 RNA stnpA 的鉴定和表征：在先前对携带不同耐药质粒细菌的 RNA - seq 分析中，研究人员发现了一种位于 Tn2 转座酶 tnpA 残留基因上的新型 sRNA，命名为 stnpA。通过定量聚合酶链反应（qPCR）验证，发现携带 pNDM - HN380ΔtnpA 质粒的大肠杆菌 J53 和 CFT073 菌株中，stnpA 的表达相较于野生型质粒显著降低。利用 5' 和 3' RACE 技术确定了 stnpA 的转录起始位点和终止位点，其长度为 342 nt。Northern blot 分析进一步证实了 stnpA 的存在和大小。通过序列分析和实验验证，鉴定出 stnpA 基因上游存在一个潜在的 σ⁷⁰依赖型启动子，对启动子区域进行突变分析发现，该启动子对 stnpA 基因的表达具有调控作用。
2. stnpA 是一种常见于流行多药耐药质粒中的小 RNA：对 pNDM - HN380 质粒中 stnpA 转录盒的鉴定表明，它转录于部分 Tn2 tnpA 基因中间，该基因在细胞中无法表达。BLAST 分析显示，stnpA 基因在其他多药耐药（MDR）质粒中高度保守，主要存在于 IncF 和 IncX 等质粒组中，这些质粒常见于病原菌中，与抗菌耐药性和毒力基因的传播有关。通过构建系统发育树，发现 stnpA 在多种病原菌的结合性质粒中都具有保守性。
3. 磷霉素应激诱导 stnpA sRNA 的表达：研究人员用亚致死浓度（1/4 MIC）的多种抗生素处理携带 pNDM - HN380 质粒的大肠杆菌 CFT073 菌株，发现只有亚致死浓度的环丙沙星和磷霉素能增强 stnpA 的表达，而四环素则会降低其表达。进一步研究发现，stnpA 的表达对低至 1/128 MIC 的磷霉素浓度都敏感。通过测定携带野生型质粒和 stnpA 缺失突变体质粒的细菌对磷霉素的最小抑菌浓度（MIC）和进行时间 - 杀伤实验，发现 stnpA 虽然不影响磷霉素的 MIC，但能显著提高细菌在磷霉素处理后的存活率，增强细菌对磷霉素的耐受性。
4. stnpA sRNA 与假定的 ABC 转运蛋白 YadG 的相互作用：为探究 stnpA 调节磷霉素耐受性的机制，进行了 RNA 下拉实验和质谱分析，发现一种假定的 ABC 转运蛋白 ATP 结合蛋白 YadG 可能与 stnpA 相互作用。通过 RNA 免疫沉淀和 Western blot 分析、EMSA 等实验，证实了 stnpA RNA 与 YadG 蛋白具有高亲和力和特异性的结合。细菌三杂交（B3H）实验也表明，在细胞内 stnpA RNA 与 YadG 蛋白能够相互作用。
5. stnpA sRNA 以 YadG 依赖的方式增强磷霉素耐受性：构建 yadG 基因缺失的大肠杆菌 J53 突变株（J53ΔyadG），研究发现，在野生型细菌中，过表达 stnpA RNA 能显著增强磷霉素耐受性，提高细胞存活率；但在 J53ΔyadG 突变株中，这种增强作用消失。比较携带不同质粒（pNDM - HN380 和 pNDM - HN380ΔstnpA）的野生型和 yadG 缺失突变株的磷霉素耐受性，结果表明 stnpA RNA 对磷霉素耐受性的调节依赖于 YadG。
6. stnpA RNA 以 YadG 依赖的方式调节磷霉素积累：测定不同实验菌株对磷霉素的 MIC，发现携带 YadG 的菌株相较于 YadG 缺失菌株，对磷霉素的 MIC 更高，且过表达 YadG 能进一步增强对磷霉素的抗性。通过抗生素积累实验发现，YadG 能促进磷霉素的外排，降低细胞内磷霉素的积累，从而提高细胞的存活率。过表达 stnpA RNA 能减少细胞内磷霉素的积累，但在 YadG 缺失突变株中，这种作用不明显，说明 stnpA 通过与 YadG 相互作用，调节磷霉素的积累，进而影响细菌对磷霉素的耐受性。
7. stnpA 是 YadG 活性的可能调节因子：比较不同菌株中 yadG 的转录和蛋白表达水平，发现 stnpA 的存在与否对 yadG 的表达没有显著影响。利用 AlphaFold 3 预测 stnpA 与 YadG 的结构相互作用，发现二者存在两批广泛的 RNA - 蛋白质相互作用，这种相互作用可能诱导 YadG 的构象变化，从而增强其活性，减少磷霉素的积累。

讨论

转座子在细胞基因组中能够移动，对基因组功能的改变和许多基因组的进化都有着重要影响。然而，人们对转座子衍生的 sRNA 及其在细菌中的功能作用了解甚少，且这类 sRNA 通常存在于细菌基因组而非质粒等可移动元件上。在本研究中，科研人员发现并鉴定了一种新型 sRNA——stnpA，它位于 Tn3 家族转座子基因内，广泛分布于病原菌的耐药质粒上。stnpA<