丝状真菌抗真菌药物耐受性与持留性研究进展：定义、检测方法与意义

《mBio》：Toward the consensus of definitions for the phenomena of antifungal tolerance and persistence in filamentous fungi

本文针对丝状真菌，提出抗真菌药物耐受性和持留性的定义及检测方法，助力相关研究。

　　### 丝状真菌抗真菌药物耐受性与持留性研究进展：定义、检测方法与意义
在真菌病原体研究领域，抗真菌药物耐受性和持留性逐渐受到重视。然而，当前真菌学界在相关术语和研究方法上缺乏统一标准，尤其是丝状真菌，其研究复杂度远超单细胞微生物。为规范该领域研究，本文提出了丝状真菌耐受性和持留性的精准定义，并推荐了实验室检测和研究的有效方法。

1. 微生物对抗菌药物的不同反应

微生物面对抗菌药物时，会展现出耐药性、异质性耐药、耐受性和持留性等多种现象。耐药性是指菌株能在高于最低抑菌浓度（MIC）的高浓度药物环境下正常生长，这依赖于基因组中特定的遗传序列（固有或获得性） 。异质性耐药则是指敏感菌株的部分细胞亚群在药物存在时，可临时提高 MIC，且基因组序列无改变。

耐受性和持留性与上述两种现象不同，它们描述的是微生物在高于 MIC 的杀菌药物浓度下存活的能力，但两者也存在差异。在细菌研究中，耐受性指敏感的同基因菌株所有细胞在高于 MIC 的杀菌药物浓度下长期存活的能力；持留性则是指敏感同基因菌株中一小部分（通常为 0.01%）“持留菌” 细胞在高于 MIC 的杀菌药物浓度下长期存活的能力 。

在细菌领域，相关研究已持续超二十年，众多潜在机制被揭示，并且学界普遍认为耐受性和持留性可能是耐药性发展的诱因，进而导致治疗失败。相比之下，致病真菌的耐受性和持留性研究较少，其对感染结局的影响也尚不明确。而且在定义和研究方法上，细菌研究已达成一定共识，但真菌领域仍较为混乱。在酵母研究中，耐受性的定义与细菌有所不同，它可用于描述细胞在高于 MIC 浓度的抑菌和杀菌药物环境下缓慢生长的能力。

2. 丝状真菌研究的复杂性及选择研究对象的考量

丝状真菌的研究面临诸多挑战。其复杂的生命周期包含多种形态，如菌丝、分生孢子等，各形态具有独特特性。在实验室研究中，以菌丝网络（菌丝体）为研究对象存在困难，难以准确量化细胞数量，导致依赖定量输出的实验，如计算最低杀菌时间（MDK₉₉）等无法进行。同时，年轻菌丝或早期萌发孢子（芽管）的均一培养物的量化和标准化也颇具挑战，因为孢子萌发不同步。

鉴于上述问题，目前抗真菌研究通常选用无性孢子（分生孢子）作为研究对象。临床和实验室标准协会以及欧洲抗菌药物敏感性试验委员会的标准化协议，在检测丝状真菌的抗真菌耐药性时，也采用分生孢子。而且，研究发现菌丝的 MIC 可能高于分生孢子。因此，本文建议采用分生孢子作为检测丝状真菌耐受性和持留性的标准方法，以确保研究方法的一致性。

3. 重新定义抗真菌药物的杀菌标准

目前，定义杀菌药物的金标准源自细菌研究，即要求在 24 小时内杀死 99.9%（或 3 个对数单位减少）的细胞。然而，由于大多数抗菌药物（包括抗生素）发挥作用需要微生物处于 “活跃生长” 状态，而真菌孢子通常处于休眠状态，所以对于真菌孢子而言，达到这一标准颇具难度。例如，对于像唑类药物（其活性依赖于真菌生长）作用于具有异步分生孢子萌发特性的烟曲霉（Aspergillus fumigatus）时，在体外往往难以达到该杀菌标准。

不过，伏立康唑能有效杀死烟曲霉的菌丝和分生孢子，在 24 小时内对分生孢子的杀伤效率超 95%，这一效率已被证实足以检测持留性。而且多种杀菌药物对不同丝状真菌物种也能达到类似的杀伤范围。因此，本文建议在研究耐受性和持留性之前，先分析特定药物对特定丝状真菌物种孢子的作用。若一种药物能在 24 小时内杀死≥90% 的某物种所有分离株的孢子（MDK₉₀ ≤ 24 h），则可将其视为杀菌药物。

4. 丝状真菌耐受性和持留性的定义

基于上述分析，本文为丝状真菌的耐受性和持留性给出了明确的定义。抗真菌耐受性指敏感分离株的所有或大部分孢子在高于 MIC 的药物浓度下长期存活的能力。这意味着耐受性菌株的 MDK₉₉、MDK_99.9和 MDK_99.99均长于非耐受性菌株。

抗真菌持留性指敏感分离株中一小部分（通常 < 0.1%）孢子在高于 MIC 的药物浓度下长期存活的能力。具体表现为持留性菌株的 MDK₉₉与非持留性菌株无明显差异，但 MDK_99.9和 MDK_99.99长于非持留性菌株。

5. 检测丝状真菌耐受性和持留性的方法

为检测和量化丝状真菌的耐受性和持留性，可借鉴细菌研究中的方法。本文推荐的金标准方法是在液体培养基中，使用高浓度（建议为 MIC 的 4 - 10 倍）的杀菌抗真菌药物绘制杀伤曲线。在实验过程中，将孢子在不同时间点用抗真菌药物处理，然后清洗并接种到不含药物的丰富培养基上，计算菌落形成单位（CFUs）。通过计算达到 MDK₉₉、MDK_99.9和 MDK_99.99的时间，来判断菌株是否具有耐受性或持留性。需要注意的是，具体测量 CFUs 的时间点和阈值应根据不同的药物 - 真菌物种组合进行确定。

除杀伤曲线法外，扩散试验（如纸片扩散法或 E - test 法）也可用于检测耐受性和持留性。这些方法虽为半定量方法，但可用于大规模菌株筛选。在实验中，将分生孢子接种在不含药物的固体培养基上，放置浸有抗真菌药物的纸片或 E - test 条带。培养后，观察到纸片周围出现生长抑制晕。此时，部分具有耐受性或持留性的菌株可能在抑制晕内有菌落生长。为准确检测，需在药物培养期后，用含有能逆转药物作用的化合物的纸片（若有）或新鲜培养基替换原纸片，使存活的孢子能够萌发和生长，从而被检测到。不过，由于在固体培养基上难以精确量化孢子数量，该方法难以区分耐受性和持留性，所以阳性结果需通过杀伤曲线和 MDK 测定进行验证。

6. 抑菌药物与耐受性、持留性的关系

若抗真菌药物在 24 小时内无法达到 90% 的杀伤阈值，则应被视为抑菌药物。对于抑菌药物，耐受性和持留性的定义并不适用。例如，棘白菌素类药物无法杀死烟曲霉的分生孢子，丝状真菌在抑菌药物存在时通常仍能显著生长，这种现象被称为拖尾或矛盾效应生长。

7. 研究意义与展望

本文为丝状真菌的耐受性和持留性提供了量身定制的定义，统一了相关术语，为后续研究提供了一致性标准，有助于推动该领域的深入发展。同时，所提出的检测和研究方法也为未来的科研工作提供了重要参考。后续研究可基于这些定义和方法，进一步探究丝状真菌耐受性和持留性的分子机制、影响因素以及它们与临床治疗效果之间的关系，为开发更有效的抗真菌治疗策略奠定基础。

总之，对丝状真菌抗真菌药物耐受性和持留性的深入研究，将为解决真菌感染的临床治疗难题提供新的思路和方法，具有重要的理论和实践意义。