HIV-1 入侵宿主细胞关键机制新发现：Env 三聚体协同作用与入侵计量学解析

《mBio》：Inter-protomer opening cooperativity of envelope trimers positively correlates with HIV-1 entry stoichiometry

本文通过新模型探究 HIV-1 包膜糖蛋白（Env）三聚体协同作用，揭示入侵计量学（T）和原体间开放协同性（S）关联，助力 HIV 研究。

　　

HIV-1 入侵宿主细胞研究背景

人类免疫缺陷病毒 1 型（HIV-1）可引发慢性感染，若不治疗会发展为艾滋病。HIV-1 入侵宿主 CD4⁺靶细胞的首要步骤是病毒膜与靶细胞膜融合，这一过程由 HIV-1 表面包膜（Env）糖蛋白介导，Env 糖蛋白需与细胞表面受体 CD4 以及共受体 CCR5 或 CXCR4 分子相互作用。Env 是三聚体结构，每个原体包含与受体 / 共受体结合的亚基 gp120 和跨膜亚基 gp41。当 CD4 与 Env 结合后，Env 会经历多步 gp120 开放过程，以暴露与共受体结合的关键结构成分，随后与共受体的相互作用会进一步引发 gp41 的一系列结构重排，最终形成稳定的六螺旋束，推动病毒膜与细胞膜融合。

尽管随着结构技术的发展，人们对 Env 三聚体中三个原体在与 CD4 分子相互作用时的协同开放有了一定认识，但对于下游融合事件仍知之甚少。例如，共受体如何与开放的 Env 三聚体相互作用，gp41 在与共受体结合后会发生哪些构象变化，以及在导致细胞进入的有效融合事件中，有多少个 Env 三聚体协同工作等问题，都有待解决。其中，入侵计量学（T），即介导病毒膜融合或使 HIV-1 病毒体具有感染性所需与宿主受体相互作用的 Env 三聚体数量，其数值直接影响病毒群体中病毒体对感染的贡献，以及对抑制或抗体中和的敏感性，然而这一关键参数至今尚未明确。

此前，估计 HIV-1 入侵计量学的常用方法是数学建模结合假型病毒体的感染性数据。但这些研究存在诸多问题，如使用的数学模型在将异源三聚体比例转化为相对病毒感染性时，基于不同假设，导致对 T 值的估计差异较大；同时，研究中往往未考虑功能性 Env 三聚体在病毒体上的分布情况，且多数研究仅使用复制缺陷型假病毒体，未涉及复制型病毒体。此外，以往模型很少同时考虑原体间开放协同性（S，反映一个原体中 CD4 诱导的构象变化对相邻原体开放的影响）和病毒体三聚体数量分布，这些因素都使得对 HIV-1 入侵计量学的研究难以达成共识。

研究方法与实验设计

在本研究中，研究人员为深入探究 HIV-1 的入侵机制，采用了一系列创新的研究方法与精心设计的实验。首先，在细胞和质粒方面，选用 HEK293T 细胞来生产复制型和假型 HIV-1 病毒颗粒，TZM-bl 细胞则作为靶细胞用于量化病毒感染性。研究使用分别编码 BG505、JR-FL 和 NL4-3 三种 Env 毒株的质粒，其中 BG505 和 JR-FL 属于临床中和抗性的 Tier 2/3 毒株，NL4-3 是实验室适应的中和敏感 Tier 1 毒株。同时，通过定点突变构建了 CD4 结合缺陷型 D368R Env 质粒，并使用内含子调节的荧光素酶质粒（HIV-1-InGluc）作为报告基因。

在病毒感染性测定实验中，研究人员制备了复制型和假型病毒体。以复制型 NL4-3 病毒体为例，通过将野生型 NL4-3 和突变型 Env 按不同比例（10:0、9:1 等）共转染 HEK293 细胞，并加入 HIV-1-InGluc，从而获得表面整合有混合三聚体（包含野生型和 D368R Env）的病毒体。假型病毒体的制备方法类似，如携带混合 JR-FL（或 JR-FL L193A）三聚体的假型病毒体，是通过将 pCAGGS JR-FL 野生型和突变型 Env 与骨架 NL4-3 deltaEnv 及报告基因 HIV-1-InGluc 共转染 HEK293 细胞得到。在转染 40 小时后收获病毒体，过滤后加入到稳定表达 CD4 和 CCR5/CXCR4 的 TZM-bl 细胞中。48 小时后，通过测量高斯荧光素酶活性来量化病毒感染性，并将相对病毒感染性表示为 CD4 结合缺陷型 D368R 突变体 Env 编码质粒比例的函数。

为了更准确地估计入侵计量学（T）和原体间开放协同性（S），研究人员构建了数学模型。该模型假设病毒体上功能性 Env 三聚体的数量遵循离散化的 Beta 分布，通过两个形状参数来表示平均三聚体数量（mean，μ）和标准差（std，δ）或方差（var，δ²）。在模型中，研究人员考虑了不同的原体间开放协同性水平，将其简化为 S = 1、S = 2 和 S = 3 三个等级。S 代表一个三聚体中使 Env 失去功能所需的 CD4 结合缺陷型原体数量，S = 3 表示一个功能性原体足以补偿其他缺陷型原体的功能损失，反映出高水平的开放协同性；而 S = 1 和 S = 2 则分别表示低和中等水平的开放协同性。通过这些假设和参数设置，研究人员利用模型拟合实验数据，从而探索 T 和 S 在不同病毒体三聚体数量分布下的变化情况。

研究结果

感染性、病毒体三聚体数量和入侵计量学之间的相互作用

研究人员首先预测了病毒体三聚体分布和入侵计量学与病毒群体感染性之间的联系。通过数学分析发现，入侵计量学 T 可被视为病毒群体中感染性和非感染性病毒体的临界值，即只有当病毒体上的三聚体数量大于或等于 T 时，病毒体才能对感染产生贡献。对于具有特定三聚体分布的病毒群体，随着 T 值升高，群体中感染性病毒体的百分比会降低；反之，T 值降低，感染性病毒体百分比则会升高。而且，在相同 T 值的情况下，平均每个病毒体上三聚体数量较多的毒株，其群体中感染性病毒体的百分比更高，在感染方面更具优势。这一结果与之前观察到的入侵计量学与病毒感染性之间的负相关关系相符，同时也表明这种相关性会受到病毒体三聚体数量分布的影响。

CD4 结合缺陷型 Env 在复制型或假型病毒体异源三聚体中的构成

研究选择 CD4 结合缺陷型 D368R 突变体作为入侵缺陷型 Env，这是因为 368D_Env与 CD4 的 59R_CD4之间形成的盐桥是 Env - CD4 相互作用的关键接触点，D368R 突变会破坏这一盐桥，使 Env 无法结合 CD4。实验观察到，携带 100% D368R Env 的病毒体相对于携带 100% 野生型 Env 的病毒体，其基线感染性信号约为 0%。此外，D368R Env 在表达水平和病毒体整合方面与野生型 Env 相当，这为准确估计入侵计量学提供了有利条件。

研究人员使用携带野生型和 D368R Env 异源三聚体的复制型和假型病毒体进行感染性测量，涵盖了 NL4-3、BG505 和 JR-FL 等多种毒株，以及更开放的 JR-FL L193A 变体。通过在 TZM-bl 细胞上测定这些异源三聚体病毒体的感染性曲线，并将测量的感染性表示为 D368R 比例的函数，为后续通过数学模型估计入侵计量学和原体间开放协同性提供了重要的实验数据。

考虑原体间开放协同性和病毒体三聚体分布的计量学参数

研究人员构建的数学模型综合考虑了原体间开放协同性（S）和病毒体三聚体数量分布这两个在以往研究中常被忽视的参数。模型采用离散化的 Beta 分布来模拟功能性 Env 三聚体在病毒体上的分布，并且不局限于特定的平均三聚体数量，而是在广泛的现实范围内筛选平均和标准差的任意组合，从而生成 T 估计值的矩阵。

通过该模型模拟不同 S 值和病毒体三聚体数量分布下的感染性曲线发现，T 估计值会随着 S 值和病毒体三聚体数量分布的变化而显著改变。这一结果有力地证明了入侵计量学（T）对病毒体三聚体数量分布和原体间开放协同性的依赖性，表明在研究 HIV-1 入侵机制时，必须同时考虑这两个因素，才能更准确地理解病毒的感染过程。

NL4-3 表现出高开放协同性但需要更多三聚体才能入侵

对 NL4-3 毒株进行模型拟合分析时，研究人员根据先前实验测定的 NL4-3 病毒体上平均约 14 个三聚体，标准差为 7 这一数据，初步估计出 S = 3 和 T = 20。经过 100,000 次重复的自展验证，进一步证实了这一结果。与之前未考虑 S 值时报道的 NL4-3 入侵所需的 4 - 7 个三聚体相比，本研究中估计的 T 值明显更高。

随后，研究人员放宽了预先定义的三聚体分布，将平均三聚体数量设置为 1 - 30，标准差设置为 1 - 10。在这一广泛的范围内进行探索，发现当每个病毒体的平均三聚体数量为 9 个或更多时，S = 3 在 S 矩阵中占主导地位；而在平均三聚体数量较少的区域，S = 1 或 S = 2 也有出现的可能性。T 矩阵的热图显示，T 值随着每个病毒体上三聚体数量的增加而增加。如果每个病毒体平均有 14 个三聚体，那么 NL4-3 入侵所需的三聚体数量在大多数情况下不少于 13 个。通过相关性分析还发现，S 和 T 之间存在高度正相关，皮尔逊相关系数达到 0.8285，这表明在 NL4-3 毒株中，原体间的开放协同性与入侵所需的三聚体数量之间存在紧密的联系。

阳性 S - T 相关性在 BG505 Env 中持续存在，且 BG505 Env 表现出难以开放的特征

对于中和抗性的原发性 Env 毒株 BG505，研究人员根据之前 ELISA 实验测定的其病毒体上平均 10 个三聚体，以及受限的标准差这一数据，对携带 D368R 异源三聚体的复制型 HIV-1_Q23 Env_BG505的感染性曲线进行拟合，估计出 S = 1 和 T = 9，并通过自展验证确认了这一结果。S = 1 表明 BG505 Env 三聚体的开放协同性较低。

在对三聚体数量分布不做限制的情况下，研究发现 S = 1 在 S 矩阵中占主导地位，但在平均三聚体数量较多（大于 8 个）且病毒体间三聚体数量变化较小（标准差为 1 - 4）的区域，S = 2 也较为常见，而 S = 3 则未被观察到。这充分说明 BG505 Env 三聚体难以开放，其原体间的开放补偿能力较低或处于中等水平。与之前报道的 BG505 的 T 值（2 或 3）相比，本研究中估计的 T 值明显更大。在广泛的三聚体数量分布范围内（平均 1 - 30，标准差 1 - 100），BG505 的 T 估计值很少低于 3，若以平均 10 个三聚体 / 病毒体计算，所有的计量学估计值都不少于 7（T ≥ 7）。对 BG505 进行线性 S - T 相关性分析发现，其也呈现出正相关，相关系数为 0.5886，这表明阳性 S - T 相关性并非 NL4-3 毒株所特有，而是 Env 的一个内在特征。

更开放的 JR-FL L193A Env 比主要呈封闭状态的野生型需要更多三聚体才能入侵

研究人员还对 JR-FL Env 的野生型和更开放的 L193A 变体进行了 S 和 T 的估计与比较。L193A 变体是由于 gp120 V1/V2 中一个限制 Env 开放的关键残基发生改变，使其比野生型更倾向于采样下游开放构象。根据报道的 JR-FL 平均 12 个三聚体及均值定义的方差，估计野生型 Env 的 S = 1 和 T = 7。在广泛的三聚体数量分布范围内，JR-FL 的 S 分布大多在 1 或 2，与 BG505 的开放协同性相似，T 估计值至少为 7，且随着变异的增加呈现上升趋势。S 和 T 之间呈现出强正相关，相关系数为 0.7701。

对于 L193A JR-FL，其 T 估计值为 9，高于野生型的 7，而 S 值与野生型相当。在 T 估计值相对较大的区域，S = 2 出现，这是由较大的平均三聚体数量和较低的标准差的三聚体分布所决定的。这表明，表现出倾向于采样融合下游构象的 Env，可能比主要呈封闭状态的 Env 需要更多的三聚体才能实现 HIV-1 的入侵，进一步说明了 Env 的构象与入侵所需三聚体数量之间的关系。

研究讨论

HIV-1 入侵计量学及其测定的挑战

HIV-1 入侵计量学在病毒感染过程中起着关键作用，它定义了病毒入侵宿主细胞所需与细胞受体相互作用的 Env 分子数量，是区分病毒库中感染性和非感染性病毒体的重要阈值。了解入侵计量学对于预防或限制病毒入侵具有重要意义，例如可以为中和抗体、小分子或融合抑制剂提供阻断目标，以确保病毒体上的功能性三聚体数量低于 T 值，从而阻止病毒感染。

然而，目前 HIV-1 入侵的计量学要求尚未完全明确，这与研究过程中面临的技术和实验限制有关。尽管有研究尝试通过电子显微镜直接计数 Env 三聚体，但由于技术限制，对于观察到的结构是否代表 Env 三聚体存在不确定性。例如，在病毒 - 细胞接触区域观察到的 5 - 7 个杆状形状密度（“entry claw”）以及 2 - 3 个 “spokes”，难以确定它们是否为 Env 三聚体。虽然结合异源三聚体病毒体感染性和数学建模为估计入侵计量学提供了一种实用方法，但不同研究中模型和实验的差异（如使用不同的入侵缺陷型突变体、对三聚体数量分布的假设不同以及感染性测量的偏差等），导致对 T 值的估计存在较大差异，难以达成共识。

入侵计量学的估计：现状与进展

尽管目前对 T 值的估计存在差异，但研究人员一直在从数学和实验两个方面努力提高其准确性。本研究在以往研究的基础上进行了拓展，使用了复制型病毒体、与 T 定义密切相关的 CD4 结合缺陷型 D368R 突变体，并在模型中考虑了开放协同性和病毒体三聚体数量分布。结果发现，本研究中对 BG505、NL4-3 和 JR-FL 的 T 值估计均大于先前研究，例如 NL4-3 在每个病毒体平均有 14 个三聚体的情况下，T 值不少于 13；BG505 和 JR-FL 的 T 值平均不少于 7。这些结果与近期冷冻电镜观察到的 Env - CD4 聚集和环形成现象相符，也与 “entry claw” 所暗示的至少 5 - 7 个三聚体的计量学结果相呼应。

此外，本研究首次从单一估计扩展到生成 T 值分布，并在病毒体三聚体数量分布的地图上展示，为深入了解 T 值随病毒体三聚体数量分布的变化趋势提供了独特视角。虽然研究模型存在一定局限性，如未考虑其他可能影响 S/T 值的生物学相关参数或实验条件，但通过对多种毒株和不同实验条件下的感染性曲线进行分析，发现 S 和 T 之间始终呈现正相关，这一关键发现为进一步研究 HIV-1 入侵机制提供了重要线索。

深入探究 Env 的协同作用

Env 三聚体在病毒体上存在多种协同方式。入侵计量学（T）体现了多个三聚体协同执行生物学过程，代表了三聚体间的协同作用；而原体间开放协同性（S）则反映了单个三聚体内三个原体的协同工作方式。以往研究中对 Env 三聚体的协同作用已有一定描述，如不对称开放现象表明一个 CD4 结合的原体可以影响相邻原体的构象，从而使三聚体开放。不同毒株在感染细胞时对 CD4 和 CCR5 分子的需求差异，也体现了原体间开放协同性的不同程度。

在本研究中，研究人员将原体间开放协同性整合到入侵计量学的估计中，发现所有测试的 Env 毒株或构建体中，S 和 T 之间都存在显著的正相关。中和敏感的 Tier 1 Env 毒株 NL4-3 具有较高的开放补偿能力，这与其三聚体更易开放的构象相符；而中和抗性的 Tier 2 Env 毒株 BG505 和 JR-FL 则表现出较低和中等的开放补偿能力，这可能与它们倾向于处于封闭构象有关。更开放的 JR-FL L193A 需要更多的 Env 三聚体才能入侵，这进一步支持了具有高原体间开放协同性的 Env 三聚体往往需要更多三聚体才能实现病毒入侵的观点。这种相关性从热力学角度为病毒膜融合提供了解释，暗示了病毒入侵过程中 Env 协同作用可能存在的内在平衡，即易于开放的 Env（高 S）可能需要招募更多的 Env 三聚体（大 T）来补偿融合所需的总能量。

综上所述，本研究综合考虑了<