精准测定胰岛素颗粒 pH：解锁 β 细胞分泌关键密码

为解决胰岛素分泌颗粒（ISG）绝对 pH 值可靠测量问题，研究人员利用基因编码的 E1GFP pH 报告基因和荧光寿命成像显微镜（FLIM）技术开展研究，证实了 ISG 的酸性本质及近膜颗粒更酸的特性，为相关生理和疾病研究奠定基础。

　　

一、研究背景

胰岛素，作为调节血糖的关键激素，它的故事始于内质网。在这里，胰岛素以未成熟的前胰岛素原形式诞生，随后摇身一变成为胰岛素原，踏上前往反式高尔基体网络（TGN）的旅程，最终进驻胰岛素分泌颗粒（ISG）。在 ISG 中，酸性环境至关重要，它不仅助力胰岛素原转化为具有活性的胰岛素，还在 ISG 的成熟与分泌过程中发挥着不可或缺的作用。

然而，长期以来，科研人员在探索 ISG 内绝对 pH 值的道路上困难重重。早期对 ISG 腔内 pH 值的测量，虽然确定了其处于 5.0 - 6.0 的酸性范围，且维持酸性依赖 ATP，但这些测量是在脱离细胞自然环境的孤立颗粒上进行的。后来，pH 敏感荧光探针的出现带来了新的希望，像吖啶橙（AO）、LysoSensor 系列等探针被用于细胞内颗粒 pH 值的研究。但 AO 因自身光物理特性，无法准确给出细胞内颗粒的实际 pH 值；LysoSensor 系列虽然各有特点，可有的无法进行绝对 pH 定量，有的测量结果存在争议，而且这些探针都存在特异性不足的问题，会分布于细胞内所有酸性区室，干扰 ISG pH 值的准确测量。即便有研究尝试将基因编码的 pH 传感器靶向胰岛素分泌途径，但仍无法同时满足特异性靶向和校准获取绝对 pH 值这两个关键要求。

为了突破这些困境，来自 [第一作者单位] 的研究人员决心深入探索，力求精准测量 ISG 的绝对 pH 值，为揭开胰岛素分泌的神秘面纱奠定基础。

二、研究概述

本研究发表于Nature Communications期刊。研究人员通过将基因编码的 E1GFP pH 报告基因插入胰岛素原的 C 肽（C-pep）中，并在 Insulinoma 1E 细胞中表达，成功实现了对 ISG 的特异性靶向。随后，利用基于相量的荧光寿命成像显微镜（FLIM）技术，他们对胰岛素颗粒 pH 值进行了校准且不受探针浓度影响的测量，最终获得了一系列关键成果，为胰岛素分泌相关生理和疾病研究开辟了新道路。

三、研究方法

1. 构建质粒：对已有的 C-pep-EGFP 质粒进行定点突变，构建出 C-pep-E1GFP 质粒；同时构建用于细菌表达重组 His-tagged E1GFP 的 pET-His-E1GFP 质粒等。
2. 细胞相关操作：培养 INS-1E 细胞，进行转染实验，并设置不同处理组，如用药物处理、进行葡萄糖刺激等。
3. 测量技术：运用 FLIM 技术，结合相量分析，对体外和细胞内的 E1GFP 进行 pH 相关测量；还通过共定位分析验证 C-pep-E1GFP 在细胞内的定位情况。
4. 数据分析：对实验数据进行统计学分析，利用 Shapiro-Wilk 检验检查数据正态性，通过单因素方差分析（ANOVA）评估统计显著性。

四、研究结果

1. E1GFP 作为细胞内 pH 探针的特性：E1GFP 属于 Y66 - 色蛋白家族，其 66 位酪氨酸残基的质子化酚基团使蛋白光学性质对 pH 敏感。研究人员在体外对重组 His-tagged E1GFP 进行表达和纯化，测量其在不同 pH 溶液中的荧光寿命。结果显示，激发态的 A' 和 A 状态荧光寿命不同，A 状态荧光呈单指数衰减，τ = 3.5 ns；A' 状态呈双指数衰减，平均寿命 <τ> = 0.83 ns。通过 FLIM 测量不同 pH 值下纯化蛋白的荧光寿命，并进行相量分析，发现 pH 校准的相量重心呈线性分布，证实了 E1GFP 可用于基于 FLIM 的细胞内 pH 测量。
2. C-pep-E1GFP 传感器在 INS-1E 细胞中的校准：构建的 C-pep-E1GFP 质粒转染 INS-1E 细胞后，与颗粒特异性 Zn2?指示剂 ZIGIR 共定位实验表明，E1GFP 信号与 ZIGIR 有良好共定位，证实其靶向 ISG。对转染细胞用尼日利亚菌素透化处理，在不同已知 pH 值缓冲液中孵育并进行 FLIM 分析，发现相量呈线性分布，荧光寿命与 pH 的关系符合单一位点的 S 型模型，pKa 为 5.91，表明细胞内 E1GFP 的 A'/A 平衡与体外一致，可用于报告细胞内 pH。
3. 标准培养条件下 ISGs pH 的测量：利用校准后的 C-pep-E1GFP 传感器测量 INS-1E 细胞在标准培养条件下 ISG 的腔内 pH，通过计算相量重心得出平均 pH 为 5.78 ± 0.06，证实了 ISG 的酸性本质。进一步分析发现，靠近质膜的颗粒平均 pH（5.72 ± 0.06）略低于细胞质内颗粒（5.83 ± 0.09）。用液泡 H? - ATP 酶（V-ATPase）抑制剂 concanamycin 处理细胞，颗粒 pH 迅速向中性转变；而用氯离子通道阻滞剂 R (+) - IAA - 94 处理，颗粒 pH 无显著变化，说明可能存在其他离子或对该阻滞剂不敏感的氯离子通道参与颗粒 pH 调节。
4. 葡萄糖刺激下 ISGs pH 的监测：针对文献中葡萄糖刺激对 ISG pH 影响的争议，研究人员用不同浓度葡萄糖刺激转染 C-pep-E1GFP 的 INS-1E 细胞，并用 FLIM 在不同时间点测量颗粒 pH。结果发现，虽然刺激过程中有部分颗粒因分泌而丢失，但质膜附近和细胞质内颗粒的寿命差异在分泌过程的第一阶段持续存在。尽管膜颗粒 pH 有升高趋势，但未达统计学显著水平。此外，还发现用无血清缓冲液处理时，膜相关 ISG 的 pH 会降低，表明之前观察到的 pH 降低可能是由于使用无血清缓冲液而非葡萄糖浓度降低所致。

五、研究结论与意义

本研究成功解决了 ISG 绝对 pH 值可靠测量的难题，通过基因编码的 E1GFP 和 FLIM 技术，不仅证实了胰岛素颗粒在维持细胞培养条件下的酸性本质（平均 pH 约 5.8），还揭示了靠近质膜的颗粒更酸这一特性，且该差异在葡萄糖诱导分泌的早期阶段依然存在。这一成果为后续研究胰岛素分泌的生理过程和相关疾病机制提供了重要的基础数据。从方法学角度看，基因编码的 pH 报告基因结合 FLIM 和相量分析的方法，为在细胞和组织水平精确监测 pH 提供了有力工具，有望在生命科学和医学研究的多个领域得到广泛应用。总之，本研究为深入理解胰岛素分泌过程以及相关疾病的病理机制打开了新的大门，具有重要的科学意义和潜在的临床应用价值。