编辑推荐:
为探究乳腺癌分子发病机制,天津医科大学研究人员研究 NFIX 在乳腺癌中的作用,发现其抑制癌细胞增殖,为治疗提供新方向。
研究人员通过分析 TCGA 数据库,发现 NFI 家族在多种癌症中存在异常表达,其中 NFIX 在乳腺癌中的表达明显低于正常乳腺组织。随后,他们对 20 对乳腺癌组织和正常组织进行 RT-qPCR 和免疫组化实验,进一步证实了这一结果。不仅如此,研究人员对 46 例乳腺癌患者的石蜡组织进行检测,并通过 Kaplan–Meier 曲线分析发现,高表达 NFIX 的患者无病生存期(DFS)更长。对 TCGA 数据库中乳腺癌患者数据的分析也表明,NFIX 高表达与更好的 DFS 和总生存期(OS)相关。这一系列研究表明,NFIX 在乳腺癌中低表达,且高表达与患者更好的预后相关。
以往研究提示 NFIX 基因表达与 DNA 甲基化密切相关。此次研究中,研究人员利用 cBioPortal 和 Meth Primer 在线工具,发现 NFIX 启动子区域(?1355/?1050)存在长程 CpG 岛,可能受甲基化调控。通过 BSP 测序检测乳腺癌组织和细胞系中 NFIX 启动子的甲基化状态,结果显示其表达可能与甲基化程度相关。进一步用 DNA 甲基转移酶抑制剂 AZA 处理细胞,发现甲基化水平升高会导致 NFIX 下调,证实了 NFIX 在乳腺癌中的表达受甲基化调控。
研究人员检测了正常乳腺细胞系和乳腺癌细胞系中 NFIX 的表达,发现其在乳腺癌细胞中低表达,在 MCF7 细胞系中表达最低。于是,他们构建了 NFIX 过表达的 MCF7 细胞系(MCF7-NFIX)和对照细胞系(MCF7-Vector)。体外实验(MTT、克隆形成、EdU 实验)和体内动物实验均表明,NFIX 过表达能抑制乳腺癌细胞增殖,使肿瘤生长变缓,同时下调肿瘤组织中 Ki-67 和 c-Myc 的表达。相反,下调 NFIX 则会促进乳腺癌细胞生长,这些结果充分说明 NFIX 在体内外均能抑制乳腺癌细胞增殖。
细胞周期实验发现,NFIX 过表达使 MCF7 细胞在 G2/M 期的比例增加。研究人员通过细胞同步化实验,利用胸腺嘧啶核苷诺考达唑方法将细胞同步化在 G1/S 期,然后在不同时间点分析细胞周期。结果显示,MCF7-NFIX 组 G2/M 期细胞比例显著高于对照组。免疫荧光染色和蛋白质免疫印迹实验也表明,NFIX 过表达会导致中期细胞增多、末期细胞减少,同时 Cyclin D1 和 Cyclin B1 的表达发生变化,这些结果表明 NFIX 过表达会导致乳腺癌细胞 G2/M 期阻滞。
为探究 NFIX 影响乳腺癌细胞周期的机制,研究人员发现 NFIX 过表达时,CDK1 蛋白表达显著抑制。免疫荧光实验证实 NFIX 和 CDK1 在细胞内共定位,核质分离实验表明 NFIX 会降低 CDK1 在细胞质和细胞核中的水平,免疫共沉淀实验则验证了 NFIX 与 CDK1 蛋白相互作用并结合,这一系列实验表明 CDK1 是 NFIX 的作用靶点。
通过环己酰亚胺脉冲追踪实验,研究人员发现 NFIX 过表达会使 CDK1 蛋白半衰期显著缩短,表明 NFIX 促进 CDK1 降解。用泛素化抑制剂 MG132 和溶酶体抑制剂氯喹处理细胞后发现,MG132 能显著上调 MCF7-NFIX 细胞中 CDK1 的表达,而氯喹无此作用。进一步实验表明,NFIX 过表达会促进 CDK1 的泛素化和降解,证实了 NFIX 通过促进泛素化降低 CDK1 蛋白水平。
由于 NFIX 是转录因子,研究人员探究其对 CDK1 转录水平的调控。qRT-PCR 分析显示,NFIX 过表达会降低 CDK1 mRNA 表达水平。通过 Jaspar 网站预测、ChIP 分析和双荧光素酶报告基因实验,证实 NFIX 能结合到 CDK1 启动子区域。质谱分析和免疫共沉淀实验发现转录因子 YBX1 与 NFIX 相互作用,且 YBX1 过表达会减弱 NFIX 对 CDK1 表达的抑制作用,说明 NFIX 通过与 YBX1 竞争结合 CDK1 启动子区域,抑制 CDK1 转录。
在结论与讨论部分,研究表明 NFIX 在乳腺癌组织中表达下调,过表达 NFIX 可抑制癌细胞增殖,其机制是通过抑制细胞周期 G2/M 期转换,作为转录因子调节下游基因表达,还能与 CDK1 相互作用促进其泛素化降解。这一发现提示 NFIX 可能成为乳腺癌潜在的生物标志物和治疗分子靶点,为乳腺癌的诊断和治疗提供了新的方向和理论依据。不过,研究也存在一些有待进一步探索的地方,比如 NFIX 影响 CDK1 降解的具体下游泛素化相关蛋白仍需确定,这将为深入理解 NFIX 在乳腺癌中的作用机制提供更丰富的信息,有望推动乳腺癌治疗领域的新突破。