NFIX:乳腺癌治疗的潜在新希望 —— 调控细胞周期的关键因子

【字体: 时间:2025年02月26日 来源:Cell Death Discovery 6.1

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  为探究乳腺癌分子发病机制,天津医科大学研究人员研究 NFIX 在乳腺癌中的作用,发现其抑制癌细胞增殖,为治疗提供新方向。

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  乳腺癌,这个全球范围内严重威胁女性健康的 “杀手”,一直以来都是医学领域研究的重点对象。尽管当前手术、化疗、放疗、靶向治疗以及内分泌治疗等多种手段在一定程度上改善了乳腺癌患者的预后,但对于许多晚期患者而言,病情依旧不容乐观。究其原因,人类对乳腺癌的分子发病机制尚未完全明晰,这就像在黑暗中摸索,难以找到精准有效的治疗方向。而细胞周期的异常调控在乳腺癌的发生发展中扮演着关键角色,其中,寻找能够调控细胞周期关键蛋白 CDK1(周期蛋白依赖性激酶 1)的基因,对于揭示乳腺癌细胞周期调控网络至关重要。在这样的背景下,天津医科大学的研究人员展开了一项关于 NFIX(核因子 I X)在乳腺癌中作用的研究,旨在为乳腺癌的治疗开辟新的道路。
NFIX 属于核因子 I(NFI)基因家族,此前研究表明该家族成员在多种器官的细胞增殖和分化调控中发挥着重要作用,且与多种癌症的发展密切相关。然而,NFIX 在乳腺癌中的作用却鲜有人研究,其分子机制更是迷雾重重。此次研究成果发表于Cell Death & Disease期刊,为乳腺癌的研究带来了新的曙光。
在这项研究中,研究人员运用了多种关键技术方法。他们利用公共数据库(如 TCGA 数据库)分析基因表达情况;通过 RT-qPCR(实时荧光定量聚合酶链式反应)和免疫组化实验检测组织和细胞中的基因表达水平;构建稳定表达细胞系和转染质粒来调控基因表达;借助 MTT、克隆形成、EdU 等实验评估细胞增殖能力;运用流式细胞术分析细胞周期;采用免疫沉淀、免疫荧光、ChIP(染色质免疫沉淀)、双荧光素酶报告基因等实验探究蛋白之间的相互作用和基因转录调控机制;还进行了动物实验(将癌细胞接种到小鼠体内观察肿瘤生长),从体内外多个层面深入研究 NFIX 在乳腺癌中的作用机制。

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NFIX 在乳腺癌中的表达及与生存的关系


研究人员通过分析 TCGA 数据库,发现 NFI 家族在多种癌症中存在异常表达,其中 NFIX 在乳腺癌中的表达明显低于正常乳腺组织。随后,他们对 20 对乳腺癌组织和正常组织进行 RT-qPCR 和免疫组化实验,进一步证实了这一结果。不仅如此,研究人员对 46 例乳腺癌患者的石蜡组织进行检测,并通过 Kaplan–Meier 曲线分析发现,高表达 NFIX 的患者无病生存期(DFS)更长。对 TCGA 数据库中乳腺癌患者数据的分析也表明,NFIX 高表达与更好的 DFS 和总生存期(OS)相关。这一系列研究表明,NFIX 在乳腺癌中低表达,且高表达与患者更好的预后相关。

NFIX 表达的调控机制


以往研究提示 NFIX 基因表达与 DNA 甲基化密切相关。此次研究中,研究人员利用 cBioPortal 和 Meth Primer 在线工具,发现 NFIX 启动子区域(?1355/?1050)存在长程 CpG 岛,可能受甲基化调控。通过 BSP 测序检测乳腺癌组织和细胞系中 NFIX 启动子的甲基化状态,结果显示其表达可能与甲基化程度相关。进一步用 DNA 甲基转移酶抑制剂 AZA 处理细胞,发现甲基化水平升高会导致 NFIX 下调,证实了 NFIX 在乳腺癌中的表达受甲基化调控。

NFIX 对乳腺癌细胞增殖的影响


研究人员检测了正常乳腺细胞系和乳腺癌细胞系中 NFIX 的表达,发现其在乳腺癌细胞中低表达,在 MCF7 细胞系中表达最低。于是,他们构建了 NFIX 过表达的 MCF7 细胞系(MCF7-NFIX)和对照细胞系(MCF7-Vector)。体外实验(MTT、克隆形成、EdU 实验)和体内动物实验均表明,NFIX 过表达能抑制乳腺癌细胞增殖,使肿瘤生长变缓,同时下调肿瘤组织中 Ki-67 和 c-Myc 的表达。相反,下调 NFIX 则会促进乳腺癌细胞生长,这些结果充分说明 NFIX 在体内外均能抑制乳腺癌细胞增殖。

NFIX 对乳腺癌细胞周期的影响


细胞周期实验发现,NFIX 过表达使 MCF7 细胞在 G2/M 期的比例增加。研究人员通过细胞同步化实验,利用胸腺嘧啶核苷诺考达唑方法将细胞同步化在 G1/S 期,然后在不同时间点分析细胞周期。结果显示,MCF7-NFIX 组 G2/M 期细胞比例显著高于对照组。免疫荧光染色和蛋白质免疫印迹实验也表明,NFIX 过表达会导致中期细胞增多、末期细胞减少,同时 Cyclin D1 和 Cyclin B1 的表达发生变化,这些结果表明 NFIX 过表达会导致乳腺癌细胞 G2/M 期阻滞。

NFIX 与 CDK1 的关系


为探究 NFIX 影响乳腺癌细胞周期的机制,研究人员发现 NFIX 过表达时,CDK1 蛋白表达显著抑制。免疫荧光实验证实 NFIX 和 CDK1 在细胞内共定位,核质分离实验表明 NFIX 会降低 CDK1 在细胞质和细胞核中的水平,免疫共沉淀实验则验证了 NFIX 与 CDK1 蛋白相互作用并结合,这一系列实验表明 CDK1 是 NFIX 的作用靶点。

NFIX 对 CDK1 降解的调控


通过环己酰亚胺脉冲追踪实验,研究人员发现 NFIX 过表达会使 CDK1 蛋白半衰期显著缩短,表明 NFIX 促进 CDK1 降解。用泛素化抑制剂 MG132 和溶酶体抑制剂氯喹处理细胞后发现,MG132 能显著上调 MCF7-NFIX 细胞中 CDK1 的表达,而氯喹无此作用。进一步实验表明,NFIX 过表达会促进 CDK1 的泛素化和降解,证实了 NFIX 通过促进泛素化降低 CDK1 蛋白水平。

NFIX 通过 YBX1 对 CDK1 的转录调控


由于 NFIX 是转录因子,研究人员探究其对 CDK1 转录水平的调控。qRT-PCR 分析显示,NFIX 过表达会降低 CDK1 mRNA 表达水平。通过 Jaspar 网站预测、ChIP 分析和双荧光素酶报告基因实验,证实 NFIX 能结合到 CDK1 启动子区域。质谱分析和免疫共沉淀实验发现转录因子 YBX1 与 NFIX 相互作用,且 YBX1 过表达会减弱 NFIX 对 CDK1 表达的抑制作用,说明 NFIX 通过与 YBX1 竞争结合 CDK1 启动子区域,抑制 CDK1 转录。

在结论与讨论部分,研究表明 NFIX 在乳腺癌组织中表达下调,过表达 NFIX 可抑制癌细胞增殖,其机制是通过抑制细胞周期 G2/M 期转换,作为转录因子调节下游基因表达,还能与 CDK1 相互作用促进其泛素化降解。这一发现提示 NFIX 可能成为乳腺癌潜在的生物标志物和治疗分子靶点,为乳腺癌的诊断和治疗提供了新的方向和理论依据。不过,研究也存在一些有待进一步探索的地方,比如 NFIX 影响 CDK1 降解的具体下游泛素化相关蛋白仍需确定,这将为深入理解 NFIX 在乳腺癌中的作用机制提供更丰富的信息,有望推动乳腺癌治疗领域的新突破。
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