数字测序新突破：结构化UMI助力超灵敏突变检测

为解决传统测序检测低频变异能力不足及 UMIs 应用问题，瑞典研究人员开展结构化 UMIs 用于数字测序研究，发现其可提升检测性能，对肿瘤检测等意义重大。

　　

如今，随着生命科学研究的不断深入，对基因变异检测的精度要求越来越高。在临床和基础研究的众多领域，比如癌症的诊断与治疗、药物研发、法医鉴定等，都离不开精准的基因测序技术。然而，常规测序技术在检测变异等位基因频率时，就像戴着模糊的眼镜，只能检测到 1-5% 的变异。

对于循环肿瘤 DNA（ctDNA）分析这类新兴应用来说，可靠检测低于 0.1% 的变异等位基因频率甚至单个分子的要求，传统技术根本无法满足。这就好比在大海捞针的任务中，普通的工具难以找到那根极其细微的 “针”。

为了突破这一困境，独特分子标识符（unique molecular identifiers，UMI）应运而生，它就像给基因分子贴上了独一无二的 “小标签”，在数字测序中发挥着重要作用。通过这些 “小标签”，可以追溯到原始的模板 DNA 分子，进而校正聚合酶诱导的错误，减少定量偏差。但 UMI 也并非完美无缺，它在 PCR 过程中容易产生非特异性产物，影响文库构建的整体性能。

为了解决这些问题，瑞典哥德堡大学的研究人员在 SiMSen-Seq 的基础上开发出一种改进的数字测序方法。他们设计出 19 种不同的结构化 UMI，以提升数字测序的性能。相关研究成果发表在《Genome Biology》期刊上。

在研究中，研究人员运用了多种技术方法。他们对患者的临床样本进行 DNA 提取，之后采用 SiMSen-Seq 技术进行文库构建，包括两轮 PCR 反应，再结合定量 PCR、平行毛细管电泳、熔解曲线分析以及测序等多种手段，对不同结构化 UMI 的性能进行全面评估。同时，还运用生物信息学方法对测序数据进行深入分析。

SiMSen-Seq 是一种基于 PCR 的数字测序方法，具有灵活的多重分析能力，适用于肿瘤突变分析。研究人员希望利用结构化 UMI 来减少文库构建过程中非特异性 PCR 产物的形成。

他们首先设计并评估了 19 种不同的 UMI 结构，通过对 UMI 序列进行巧妙设计，在特定位置插入预定义核苷酸，减少引物间的不良相互作用。结果发现，与传统的非结构化参考 UMI 相比，所有结构化 UMI 设计都提升了检测性能。其中，UMI 设计 III 在特异性方面表现最为突出，而 UMI 设计 X 则在高特异性的同时，还拥有较高的多样性，综合性能优异。

接着，研究人员通过多种实验进一步验证了结构化 UMI 的优势。在检测 20 ng 基因组 DNA 时，所有结构化 UMI 设计在定量 PCR 和毛细管电泳实验中都展现出比参考 UMI 更高的特异性。在后续的多项分析中，UMI 设计 X 同样表现出色，特异性得到提升。在检测低浓度 DNA 时，UMI 设计 X 在测序中能检测到更多目标分子，减少脱靶测序读数，提高检测灵敏度，并且在分析低浓度 DNA 时也表现出良好的线性关系。

在检测变异等位基因频率方面，UMI 设计 X 更是表现优异。研究人员设计了一个 20 重的热点突变检测组合，对标准化对照材料进行分析。结果显示，在检测平均变异等位基因频率为 0.1%、0.025% 和 0.01% 的样本时，UMI 设计 X 能够可靠地检测到这些极低频率的变异，且错误率低于 0.1%。此外，在检测突变 DNA 分子时，UMI 设计 X 也展现出更高的灵敏度，平均而言能检测到更多的突变 DNA 分子。

研究人员还将结构化 UMI 应用于临床样本检测。他们为一位患有平滑肌肉瘤的患者设计了个性化的 ctDNA 组合，通过对患者血液样本的长期监测发现，该组合能够检测到低于 0.01% 的变异等位基因频率，并且 ctDNA 水平与临床结果密切相关，在治疗监测方面展现出巨大的潜力。

综合来看，研究人员通过实验证明，结构化 UMI 在数字测序中具有显著优势，能够可靠检测低于 0.1% 的变异等位基因频率，提升检测灵敏度，减少检测误差。这一成果对于肿瘤的早期诊断、治疗监测以及精准医学的发展都具有重要的推动作用，为生命科学和医学研究提供了强有力的技术支持。