探究牡蛎免疫新机制：CgLRSAM1 如何介导抗弧菌免疫反应
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时间：2025年02月26日
来源：Cell Communication and Signaling 8.2
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为探究双壳贝类免疫机制及开发疾病防控策略，大连海洋大学研究人员对太平洋牡蛎 CgLRSAM1 开展研究，发现其经泛素化 - 自噬 - 溶酶体途径降解灿烂弧菌，为相关研究提供新思路。
在神秘的海洋世界里，贝类们正面临着一场看不见的 “战争”。海洋双壳贝类，像美味的牡蛎，它们每年为人类贡献超过 1500 万吨的产量，在全球海洋水产养殖中占据着约 14% 的重要地位。然而，近年来，这些贝类却遭遇了严重的生存危机，频繁爆发的大规模夏季死亡现象，让养殖户们叫苦不迭，经济损失惨重。经过研究发现，细菌感染是这场 “灾难” 的主要元凶之一，其中，弧菌属的一些成员更是罪魁祸首，对贝类的健康构成了巨大威胁。
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在生物体内，有一种名为自噬（autophagy）的机制，它就像是细胞内的 “清洁小卫士”，能够通过包裹并降解入侵的细菌来维持细胞的内环境稳定，在抵御细菌感染的免疫过程中发挥着关键作用。而泛素化（ubiquitination）则像是给细菌贴上 “坏蛋” 标签的过程，被标记后的细菌更容易被细胞识别并清除。在这个过程中，E3 泛素连接酶起着至关重要的作用，它能够特异性地识别目标底物并介导泛素转移到底物上。亮氨酸重复序列和无义 α 基序包含蛋白 1（LRSAM1）就是这样一种 E3 泛素连接酶。
之前，人们对 LRSAM1 的了解大多来自于 HeLa 细胞的研究，发现它可以识别沙门氏菌并促进其泛素化，最终介导细菌进入自噬过程。但在其他物种中，LRSAM1 在识别入侵细菌并介导其进入泛素化 - 自噬 - 溶酶体途径的具体机制还不清楚。特别是在牡蛎这类重要的海洋生物中，相关研究更是匮乏。为了填补这一空白，大连海洋大学的研究人员挺身而出，开展了一项针对太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）中 CgLRSAM1 的深入研究。
这项研究成果具有重要的意义。它不仅为我们深入理解双壳贝类的免疫机制提供了新的视角，还为水产养殖中疾病控制策略的开发提供了重要线索，有望帮助养殖户们解决贝类大规模死亡的难题，保护海洋生态环境和水产养殖业的可持续发展。目前，该研究成果已发表于相关专业期刊。
研究人员在这项研究中使用了多种技术方法。首先，通过基因克隆和序列分析技术，确定了 CgLRSAM1 的基因序列和结构特征；运用实时定量 PCR（RT-qPCR）技术，检测 CgLRSAM1 在不同组织中的表达情况以及在灿烂弧菌（Vibrio splendidus）刺激后的表达变化；采用 RNA 干扰（RNAi）技术，敲低 CgLRSAM1 的表达，以探究其功能；利用分子对接技术，预测 CgLRSAM1 与脂多糖（LPS）的相互作用；此外，还通过免疫共定位等技术，研究相关蛋白与细菌之间的关系。
研究结果
- CgLRSAM1 的序列特征和系统发育关系：研究人员克隆出 CgLRSAM1 的开放阅读框（ORF），长度为 2415bp，可编码 804 个氨基酸残基。该蛋白包含一个保守的 RING 结构域、一个 SAM 结构域和四个 LRR 结构域。通过序列比对发现，CgLRSAM1 与其他物种的 LRSAM1 相似度在 32.8% - 70.7% 之间，且预测结构域的氨基酸序列在不同物种中相对保守。系统发育分析显示，CgLRSAM1 与来自 C. virginica 的 CvLRSAM1 聚类在一起，同属于无脊椎动物分支。
- CgLRSAM1 mRNA 的时空表达谱：运用 RT-qPCR 技术检测发现，CgLRSAM1 mRNA 在太平洋牡蛎的多个组织中均有表达，其中在血淋巴中的表达量最高，是肝胰腺中的 9.07 倍。在灿烂弧菌刺激血淋巴细胞后，CgLRSAM1 mRNA 的表达量在 6h 和 24h 显著增加，分别是海水刺激组的 4.64 倍和 3.76 倍。这表明 CgLRSAM1 在牡蛎的免疫反应中可能发挥重要作用。
- rCgLRSAM1-LRRs 结合 PAMPs 和细菌的活性以及 CgLRSAM1 介导的灿烂弧菌泛素化：表达并纯化 rCgLRSAM1-LRRs 后发现，其能与革兰氏阴性菌（如大肠杆菌、鳗弧菌、灿烂弧菌）和革兰氏阳性菌（如藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌）结合，且与部分革兰氏阴性菌的结合活性更高。同时，rCgLRSAM1-LRRs 还能与 LPS、肽聚糖（PGN）和甘露聚糖（MAN）结合，且结合活性随浓度增加而增强。体外泛素化实验证实，CgLRSAM1 可作为 E3 连接酶使灿烂弧菌发生泛素化。
- CgLC3 与溶酶体，以及泛素、CgLRSAM1、Cgp62、溶酶体与灿烂弧菌的共定位：通过免疫细胞化学分析发现，在灿烂弧菌刺激后，CgLC3 与溶酶体在血淋巴细胞中的共定位增强。同时，泛素、CgLRSAM1、Cgp62 和溶酶体均与灿烂弧菌存在共定位现象，表明它们可能共同参与了对灿烂弧菌的清除过程。
- CgLRSAM1 与泛素、CgLC3 和 Cgp62 的共定位：进一步研究发现，在灿烂弧菌刺激后，CgLRSAM1 与泛素、CgLC3 和 Cgp62 的共定位显著增加，共定位细胞比例分别是海水刺激组的 3.18 倍、1.90 倍和 7.00 倍。这说明 CgLRSAM1 可能通过与这些蛋白相互作用，介导细菌的泛素化和自噬过程。
- CgLRSAM1 - RNAi 牡蛎中 CgLC3 的切割和亚细胞定位以及灿烂弧菌与泛素的共定位：利用 RNAi 技术敲低 CgLRSAM1 的表达后发现，灿烂弧菌刺激后，CgLRSAM1 - RNAi 牡蛎血淋巴细胞中 CgLC3I 和 CgLC3II 的条带强度增强，分别是 EGFP - RNAi 牡蛎的 1.20 倍和 1.40 倍，且 CgLC3 斑点状聚集增多。同时，灿烂弧菌与泛素的共定位细胞比例显著下降，为 EGFP - RNAi 牡蛎的 0.30 倍。这表明 CgLRSAM1 的缺失影响了 CgLC3 的激活和细菌的泛素化。
- CgLRSAM1 - RNAi 牡蛎中溶酶体与 CgLC3、Cgp62 和灿烂弧菌的共定位：研究还发现，在 CgLRSAM1 - RNAi 牡蛎中，溶酶体与 CgLC3、Cgp62 和灿烂弧菌的共定位细胞比例均显著下降，分别为 EGFP - RNAi 牡蛎的 0.63 倍、0.22 倍和 0.27 倍。这进一步证明了 CgLRSAM1 在介导细菌经泛素化 - 自噬 - 溶酶体途径降解过程中的重要作用。
研究结论与讨论
综合上述研究结果，研究人员发现，当 FITC 标记的灿烂弧菌逃脱血淋巴细胞的囊泡后，CgLRSAM1 的 LRRs 结构域能够识别细菌，其 RING 结构域则介导细菌的泛素化。泛素化后的细菌会招募 Cgp62 和 CgLC3，形成自噬体，自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，最终将细菌降解。这一过程表明，CgLRSAM1 介导了细胞内逃逸病原体进入泛素化 - 自噬 - 溶酶体途径进行降解。
该研究进一步证明了 LRSAM1 功能的进化保守性，为研究低等水生动物细胞内寄生细菌的控制策略提供了新的思路。同时也表明，在生命的早期进化过程中，宿主就已经进化出了复杂而精细的免疫防御机制来抵御细胞内病原体的感染。这一研究成果为后续深入研究双壳贝类免疫机制和开发水产养殖疾病防控策略奠定了坚实的基础。
