综述：Macrophage Polarization Imaging: Advances in Nanoprobe Technology for Tumor Microenvironment Monitoring

本综述聚焦于纳米探针技术在肿瘤相关巨噬细胞极化成像中的最新进展，为精准肿瘤学提供了新的视角和工具。

　　巨噬细胞在人体中无处不在，在免疫监视、炎症反应和组织稳态中发挥着关键作用。其表型可塑性是巨噬细胞的显著特征，使其能够根据局部微环境信号极化为促炎、抗肿瘤的M1型和抗炎、促肿瘤的M2型。在肿瘤组织中，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的极化深刻影响肿瘤微环境（TME），进而影响肿瘤进展、免疫逃逸和转移。因此，能够对巨噬细胞极化进行成像和监测对于理解肿瘤生物学和优化治疗策略至关重要。随着纳米医学的快速发展，多种纳米探针被设计用于特异性靶向肿瘤相关巨噬细胞，为非侵入性体内成像和实时监测巨噬细胞动态提供了新途径。

免疫治疗与巨噬细胞极化

免疫治疗作为癌症治疗中最具前景的方法之一，利用人体自身的免疫系统对抗恶性肿瘤，并提供长期保护以防止复发。肿瘤微环境（TME）中免疫细胞的浸润和激活是决定肿瘤进展和治疗结果的关键因素。巨噬细胞作为塑造TME的关键细胞，其极化为M1型（抗肿瘤）和M2型（促肿瘤）状态对肿瘤行为和患者预后具有深远影响。因此，理解M1和M2型巨噬细胞之间的动态转变对于开发更有效的免疫治疗策略至关重要。

传统诊断方法如组织学分析和流式细胞术在实时、非侵入性监测肿瘤内巨噬细胞极化状态方面存在局限性，这些方法存在组织损伤、出血和癌细胞播散的风险。因此，对更精细、微创成像工具的需求比以往任何时候都更为迫切。纳米探针的发展彻底改变了我们监测TME的能力，为体内监测巨噬细胞极化提供了一种有前景的方法。纳米探针因其能够利用增强的通透性和滞留效应（EPR）靶向递送至肿瘤部位而备受关注。到达肿瘤后，这些探针可被巨噬细胞内化，从而实现对其极化状态的特异性监测。纳米探针的独特物理化学性质，如可调节的尺寸、表面特性和光学性质，进一步增强了其性能，提供了高灵敏度、低检测限和强大的抗背景干扰能力。这些特性使其非常适合体内成像应用，实时监测巨噬细胞行为有望为肿瘤进展和治疗反应提供关键见解。

荧光和化学发光探针

在各种纳米探针类型中，荧光和化学发光探针一直处于该领域研究的前沿。荧光探针以其高灵敏度和空间分辨率而闻名，能够检测到单分子水平的事件。然而，组织自荧光和低信噪比（SBR）常常限制了其在复杂生物系统中的性能。相比之下，化学发光（CL）成像无需光学激发，通过显著降低背景噪声提供了一种有前景的解决方案，从而提高了成像清晰度和灵敏度。例如，Huang等人开发了一系列基于金刚烷基-1,2-二氧杂环己烷框架的近红外（NIR）化学发光分子（DPDO、DPDS、BPDO和BPDS）。其中，DPDO表现出卓越的CL特性，包括最高的量子产率（2.7% einstein/mol）和最长的半衰期（约7.7小时）。基于这些特性，作者将DPDO设计成一种串联锁定的NIR化学发光探针（DPDGN），该探针在一氧化氮（NO）和γ-谷氨酰转肽酶存在时被激活。这种创新设计使725 nm的CL信号增强了26.6倍，为监测TME中的巨噬细胞极化提供了一个强大的工具。流式细胞术分析和荷瘤小鼠模型表明，DPDGN的CL信号与肿瘤相关巨噬细胞极化为M1表型的程度密切相关，突显了其作为非侵入性、实时生物标志物监测抗肿瘤免疫反应的潜力。此外，DPDGN还可以通过进一步的表面修饰获得增强的靶向能力、更好的生物安全性、更高的信噪比等理想特性。深入研究DPDGN的潜在作用机制对于评估其实用应用潜力至关重要。

尽管CL在成像M1型巨噬细胞方面显示出巨大潜力，但监测与肿瘤进展和免疫抑制相关的M2型巨噬细胞群体仍然是一个研究热点。M2表型由于其在TME中的微妙和动态特性而难以靶向。然而，最近的创新已经开始解决这一挑战。Yuan等人介绍了一种新型NO响应型纳米探针（NRP@M-PHCQ），旨在特异性靶向M2样巨噬细胞。该系统将NO响应的近红外II探针（NRPs）封装在由含有甘露糖和羟氯喹（HCQ）的两性嵌段共聚物形成的聚合物胶束中。甘露糖基团赋予靶向递送至M2型巨噬细胞的能力，而HCQ通过增强NO分泌将M2型巨噬细胞极化为M1表型巨噬细胞。探针的激活由NO分泌触发，导致在900至1200 nm范围内发射NIR光，从而实现对巨噬细胞动态的灵敏成像。体内实验表明，NRP@M-PHCQ能够灵敏地追踪淋巴结和肺部的早期肿瘤转移，优于传统的生物发光成像技术。此外，M2型巨噬细胞极化为M1表型巨噬细胞抑制了肿瘤细胞生长，并几乎完全消除了转移性肺肿瘤。这项工作为通过靶向NO响应探针灵敏监测和抑制早期肿瘤转移提供了新策略，并直观展示了M2样巨噬细胞在早期肿瘤转移中的关键作用。与传统的体外亚型检测方法相比，NRP@M-PHCQ探针在原发肿瘤和肿瘤转移的长期动态监测方面具有更大的应用前景。

余辉成像与靶向标志物

余辉发光是一种分子在光刺激后释放储存能量的内在发射途径，无需持续激发。这种技术在体内背景自由分子成像方面具有巨大潜力，能够在复杂、高背景的TME环境中提供更高的灵敏度和清晰度。然而，余辉材料的时间依赖性衰减特性使得精确定量变得复杂。此外，这些材料的有限反应性和结构惰性为优化其体内应用功能带来了技术障碍。Liu等人在克服这些限制方面取得了显著进展，开发了一种新型余辉共振能量转移策略。结果是一种创新的NO响应余辉纳米探针（RAN1），旨在解决在TME中检测巨噬细胞极化的挑战。在NO激活后，由M1型巨噬细胞产生的分子，RAN1表现出明显的余辉变化——在600 nm处减少，在830 nm处增加。这种特定响应允许高信噪比成像，从而实现对M1表型巨噬细胞释放的NO的靶向检测。通过利用这种策略，研究人员创建了一个通用的比率余辉纳米探针平台（RAN），能够检测一系列分析物，包括NO、过氧亚硝酸盐（ONOO?）和pH。这些余辉探针不仅解决了余辉强度衰减的问题，还消除了外部因素（如激光功率、照射时间和曝光时间）的干扰，显著提高了体内成像的可靠性，并实现了约1200倍的信噪比提升。因此，比率余辉纳米探针平台能够准确反映巨噬细胞极化的生物标志物变化，实现对肿瘤免疫治疗程度的实时动态评估，为预测免疫治疗干预的结果提供了一个可靠的参数。然而，该研究验证了NO响应探针RAN1的可行性，而pH和ONOO?响应探针的可靠性尚未经过实验验证。此外，是否设计具有多源响应性的余辉成像探针能够更好地定位不同极化状态的巨噬细胞并提高成像精度，仍有待实验探索。尽管余辉成像具有广泛的应用前景，但其现有局限性仍需开发更可行的解决方案。

此外，监测巨噬细胞极化的另一种创新方法是靶向巨噬细胞特异性标志物，例如CD206，即巨噬细胞甘露糖受体，主要在M2型巨噬细胞上表达。Zhang等人的最新研究表明，通过使用NIR酞菁染料与单克隆抗CD206抗体偶联，创建了IRDye700-偶联的CD206抗体（IRD–αCD206）探针。该探针在非侵入性追踪肿瘤相关巨噬细胞浸润方面表现出色。在4T1荷瘤小鼠的研究中，研究人员发现索拉非尼治疗导致M2型巨噬细胞极化，通过

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荧光探针在监测M1型巨噬细胞极化时如何发挥优势？

DPDGN探针是如何设计来增强肿瘤微环境中巨噬细胞极化监测的？

IRD–αCD206探针成功实现了可视化（⁴⁰）。此外，研究人员还展示了IRD–αCD206探针的潜在治疗应用，通过结合光动力治疗（PDT），在光照条件下，探针的光动力特性能够抑制肿瘤生长并防止肺部转移，为同时实现肿瘤成像和治疗提供了新的思路。然而，酞菁染料在高光强度或长时间激发以及复杂病理环境中可能会发生光漂白或光降解，这将显著降低成像性能。因此，设计具有高稳定性的荧光染料探针对于长期实时检测具有重要意义。同时，探针的靶向能力和诊断与治疗的整合对于个性化治疗的进展至关重要。

磁共振成像与多模态成像

尽管荧光成像因其高灵敏度和空间分辨率在分子成像中占据核心地位，但在深部组织成像中存在显著局限性。荧光探针容易受到组织自荧光的影响，降低了信噪比（SBR），限制了其在复杂生物系统（如TME）中的应用。尽管正电子发射断层扫描（PET）、单光子发射计算机断层扫描（SPECT）和计算机断层扫描（CT）等成像技术在临床上具有一定的应用价值，但它们在空间分辨率、灵敏度以及无法提供细胞特异性信息方面仍面临挑战（⁴¹）。相比之下，磁共振成像（MRI）因其出色的软组织对比度和解剖细节而脱颖而出，为开发响应性对比剂以评估体内分子靶点提供了巨大潜力。

Liu等人开发了一种基于超小顺磁性氧化铁纳米颗粒（USPIO）的NO响应磁共振成像纳米探针（USPIO@OMG），该探针通过_o-苯二胺、甘露糖和钆螯合物修饰（⁴²）。该探针能够与NO分子反应，导致电荷反转并形成聚集结构，从而特异性靶向M2型巨噬细胞。流式细胞术分析显示，探针靶向的M2型巨噬细胞的平均荧光强度是M1型巨噬细胞的2.53倍，表现出强烈的浓度依赖性反应。USPIO@OMG纳米探针诱导的T1和T2弛豫变化可用于检测巨噬细胞的表型变化。该研究进一步评估了USPIO@OMG对Toll样受体激动剂R848介导的免疫治疗和X射线介导的放射治疗的肿瘤反应，使巨噬细胞极化检测技术能够为现有治疗提供免疫相关的指导和见解。

当前挑战与未来方向

尽管在通过不同成像技术检测肿瘤中巨噬细胞类型方面取得了显著进展，但该领域仍面临一些重大挑战。首先，不同的成像策略具有各自的优势和劣势，因此开发多模态成像、高灵敏度以及集成诊断和治疗的探针至关重要。这些探针能够更好地与各种检测仪器兼容，并实现同步诊断和治疗（⁴³，⁴⁴）。其次，提高信噪比、增强靶向与背景对比度以及实现巨噬细胞亚型的精确定位是显著提高巨噬细胞成像准确性和可靠性的关键因素。第三，优化纳米探针的生物相容性并最小化其毒性是其安全临床应用的必要步骤。尽管一些研究已经展示了纳米探针的短期生物安全性，但缺乏长期生物毒性测试，仍需进一步完善。第四，简化纳米探针的合成工艺并建立探针测试标准对于满足工业化生产需求至关重要。简化合成工艺不仅能够降低成本，还能提高产品的一致性和可重复性，同时避免对自然环境的潜在危害。

在癌症治疗中，巨噬细胞极化检测技术能够优化免疫细胞治疗，靶向肿瘤免疫微环境，制定特定的免疫治疗策略，提高肿瘤细胞治疗的选择性，最大限度地减少对正常细胞的损伤，并提供监测癌症免疫治疗进展的手段。此外，随着各种纳米探针进入临床试验，将纳米探针平台与肿瘤治疗策略整合将提高疾病治疗效率，并加速其临床转化。