编辑推荐：
为解决传统质粒制备 gRNA 表达模板流程繁琐的问题，研究人员开展环形载体（CV）方案的研究。结果显示，CV 方案 3 小时就能制备 gRNA 表达模板，优势显著。推荐阅读，一起探索基因组编辑新突破！
摘要
CRISPR-Cas9 基因组编辑方法的成功实施，依赖于向导 RNA（gRNA）的稳定表达。gRNA 的组成元件，包括 RNA 聚合酶启动子、gRNA 编码序列和 RNA 聚合酶终止子序列，以及 Cas9 蛋白，既可以通过一体化质粒表达，也可以通过单独的专用质粒表达。制备这类质粒需要经过多日的繁琐流程，包括 DNA 组装、细菌克隆、验证、纯化和测序。[第一作者单位] 的研究人员所提出的环形载体（Circular Vector，CV）方案，为制备适用于转染的 gRNA 表达模板提供了一种高效、全合成、无细胞的方法，相较于传统基于质粒的方法有了重大改进。该方案可将含有 gRNA 表达元件的线性双链 DNA（dsDNA）环化并纯化，在短短 3 小时内就能制备出不含细菌骨架的紧凑型环形 DNA 表达载体。[第一作者单位] 的研究人员针对 CRISPR-Cas9 碱基编辑和引导编辑，提供了编码 gRNA 元件的 dsDNA 模板设计指南，以及高效制备表达 gRNA 的 CV 的详细操作步骤。通过该方案制备的 CV 除了制备速度快之外，还具有多个显著优势：尺寸紧凑、不含细菌骨架、无细菌内毒素，并且不会受到细菌 RNA 或 DNA 片段的污染。这些特性使得表达 gRNA 的 CV 成为优于基于质粒的 gRNA 表达模板的选择。
