巨噬细胞外泌体中的 THBS1——脑缺血再灌注损伤的关键 “推手” 及丹酚酸 B 的逆袭疗法

为解决 CIRI 发病机制不明及缺乏有效治疗手段的问题，哈尔滨医科大学附属第二医院研究人员开展巨噬细胞来源外泌体对 CIRI 影响的研究。结果发现 THBS1-OTUD5-GPX4 轴的作用及 SAB 的疗效，为 CIRI 治疗提供新思路，值得一读。

　　

在医学领域，急性缺血性中风（AIS）就像一个隐藏在暗处的 “健康杀手”，时刻威胁着人们的生命和健康。它是由于脑动脉堵塞，导致脑组织瞬间陷入 “能量危机”。目前，治疗 AIS 的主要方法是尽快恢复缺血区域的血流，拯救那些处于缺血半暗带（大脑中一部分因缺血但还未完全死亡的区域）的脑组织。

然而，事情并没有那么简单。当血流恢复时，却又引发了另一个棘手的问题 —— 脑缺血 - 再灌注损伤（CIRI）。这就好比给久旱的土地突然浇了过多的水，反而对庄稼造成了伤害。CIRI 会进一步加重脑损伤，严重影响患者的预后情况。尽管近年来在治疗方面取得了一些进展，但 CIRI 的病理生理学机制十分复杂，患者的残疾率和死亡率仍然居高不下。

在 CIRI 的众多病理过程中，血脑屏障（BBB，它就像大脑的一道 “防护墙”，能选择性地过滤物质，维持中枢神经系统的稳定）的破坏是一个关键因素。一旦血脑屏障受损，血液中的有害物质就会趁机进入脑组织，造成更大的伤害。此外，铁死亡（一种特殊的细胞程序性死亡方式，其特点是活性氧物种过度产生和积累，以及铁过载导致的脂质过氧化增加）在 CIRI 中的作用也逐渐受到关注。研究发现，内皮细胞对铁死亡特别敏感，抑制内皮细胞铁死亡可以有效减轻 CIRI。但是，脑微血管内皮细胞铁死亡在 CIRI 中的调控机制却还不清楚。

同时，巨噬细胞在 CIRI 的发展过程中也扮演着重要角色。在 CIRI 发生时，巨噬细胞会大量浸润到脑组织中，它们分泌的外泌体（一种由细胞分泌的小囊泡，能在细胞间传递信息）可能会影响内皮细胞的功能。不过，巨噬细胞来源的外泌体对 CIRI 的影响及作用机制尚不明确。

为了揭开这些谜团，哈尔滨医科大学附属第二医院的研究人员在《Journal of Neuroinflammation》期刊上发表了题为 “Macrophage-derived exosomal THBS1 promotes endothelial ferroptosis and blood–brain barrier disruption via OTUD5-mediated GPX4 ubiquitination during cerebral ischemia–reperfusion injury” 的论文。研究人员发现，巨噬细胞来源的外泌体在 CIRI 过程中会诱导内皮细胞铁死亡和血脑屏障破坏，而血小板反应蛋白 - 1（THBS1）是其中的关键分子。他们还发现丹酚酸 B（SAB）能有效结合 THBS1，抑制其有害作用，为治疗 CIRI 提供了新的潜在策略。这一研究成果对于深入理解 CIRI 的发病机制，寻找新的治疗靶点具有重要意义。

在这项研究中，研究人员运用了多种技术方法来探索其中的奥秘。他们建立了动物模型（通过短暂大脑中动脉闭塞法建立 CIRI 小鼠模型）和细胞模型（构建氧 - 葡萄糖剥夺 / 复氧（OGD/R）细胞模型），以此模拟疾病发生的过程。通过蛋白质组学测序、转录组数据分析和单细胞测序，寻找关键的调控分子。同时，运用免疫印迹、免疫荧光等实验技术，检测相关蛋白的表达和定位情况。此外，还进行了分子对接、分子动力学模拟等计算分析，探究分子间的相互作用。

下面我们来看看具体的研究结果：

1. OGD/R 处理的巨噬细胞条件培养基诱导脑内皮细胞铁死亡：研究人员首先通过激光散斑对比成像和 TTC 染色，成功确认了 CIRI 小鼠模型的建立。接着，他们发现随着再灌注时间的延长，血脑屏障的完整性逐渐被破坏，相关蛋白表达下降，同时巨噬细胞浸润增加。为了进一步探究，他们将经 OGD/R 处理的巨噬细胞（模拟 AIS 相关巨噬细胞，AMφ）的条件培养基与人类脑微血管内皮细胞（HBMECs）共培养。结果发现，HBMECs 的屏障相关蛋白水平降低，细胞死亡比例增加，脂质过氧化水平上升，线粒体膜电位降低，铁死亡标记物 SLC7A11 和 GPX4 表达下调。而用外泌体合成 / 分泌抑制剂 GW4869 预处理 AMφ 后，这些变化得到了显著逆转。这表明 AMφ 介导 HBMECs 铁死亡和屏障破坏的机制可能与外泌体分泌有关。

2. AMφ 来源的外泌体诱导脑微血管内皮细胞铁死亡：研究人员从 Mφ 和 AMφ 的培养基中分离出外泌体，发现它们都具有外泌体的典型结构和标记物，并且 PKH67 标记的外泌体能被 HBMECs 内化。与 AMφ - 外泌体共培养后，HBMECs 的存活率随时间下降，细胞死亡率升高，屏障相关蛋白和线粒体膜电位水平降低，脂质过氧化水平升高，铁死亡相关蛋白水平降低。而用铁死亡抑制剂 ferrostatin - 1（Fer - 1）预处理 HBMECs 后，这些变化得到了部分逆转。这充分说明 AMφ 来源的外泌体能够诱导脑微血管内皮细胞铁死亡。

3. OGD/R 处理的 RAW264.7 细胞来源的外泌体介导小鼠脑铁死亡：为了研究 AIS 相关巨噬细胞来源外泌体在体内的作用，研究人员对 RAW264.7 细胞进行 OGD/R 处理后，分离出其外泌体，并将 DiR 标记的外泌体通过尾静脉注射到小鼠体内。结果发现，这些外泌体能够分布到小鼠大脑中，并且被内皮细胞内化。同时，注射外泌体后，小鼠大脑中的炎症细胞因子 IL - 6 和 TNF - α 水平升高，血脑屏障破坏加重，细胞死亡增加，氧化应激水平升高，GPX4 和 SLC7A11 水平下调。这表明 AIS 相关巨噬细胞来源的外泌体在小鼠体内也能诱导铁死亡，加重脑损伤。

4. 鉴定 AMφ - 外泌体中介导小鼠脑损伤的潜在调节因子：研究人员通过对 AMφ - 外泌体进行蛋白质组学测序，分析相关数据集，并构建蛋白质 - 蛋白质相互作用网络，发现 THBS1 可能是关键调节分子。进一步研究发现，THBS1 在 AIS 患者血浆外泌体中显著上调，并且与血脑屏障损伤标记物呈正相关。在临床样本、体内和体外实验中，都验证了 THBS1 在 OGD/R 处理的巨噬细胞及其分泌的外泌体、AIS 患者外周血单核细胞和 tMCAO 小鼠大脑中均高度表达。

5. THBS1 在巨噬细胞来源的外泌体中介导 CIRI 期间内皮细胞铁死亡和屏障破坏：研究人员使用 RNA 干扰技术沉默巨噬细胞中的 THBS1，发现 THBS1 沉默能够逆转 AMφ - 外泌体诱导的细胞死亡和氧化应激，增加屏障和铁死亡相关蛋白的表达，提高线粒体膜电位，降低脂质过氧化水平。相反，过表达 THBS1 则会加重 HBMECs 的损伤。在体内实验中，沉默 Thbs1 能够降低血脑屏障通透性，减少细胞死亡和氧化应激，增加屏障和铁死亡相关蛋白的表达；而过表达 Thbs1 则会加剧屏障和铁死亡相关蛋白的丢失。这充分表明 THBS1 在巨噬细胞来源的外泌体中介导了内皮细胞铁死亡和屏障破坏。

6. 巨噬细胞中 Thbs1 的敲低抑制血脑屏障破坏并减轻脑损伤：研究人员使用巨噬细胞特异性腺相关病毒敲低小鼠大脑中的 Thbs1，发现这能够显著改善血脑屏障通透性，减少神经炎症和氧化应激，增加梗死周围脑组织中 CD31?/GPX4?细胞的比例。这说明敲低巨噬细胞中的 Thbs1 能够有效减轻血脑屏障破坏和脑损伤。

7. 巨噬细胞来源的 THBS1 通过抑制内皮细胞中的 GPX4 促进 CIRI：研究人员构建了内皮细胞特异性 Gpx4 敲除小鼠，发现 Gpx4 敲除会导致血脑屏障通透性增加，屏障蛋白减少。用 AAV - shThbs1 处理 Gpx4?/?小鼠能够部分缓解这些变化，但对 Gpx4?/?小鼠则没有明显效果。这表明巨噬细胞来源的 THBS1 介导的内皮屏障破坏与内皮细胞中 GPX4 的抑制有关。

8. THBS1 通过与 OTUD5 相互作用促进 GPX4 的泛素化和降解：研究人员发现，AMφ - 外泌体处理后，HBMECs 中 GPX4 的泛素化水平显著增加，而敲低 THBS1 能够缓解这一现象。同时，用蛋白酶体抑制剂 MG132 预处理能够阻断 GPX4 的降解，说明 GPX4 的减少是通过蛋白酶体途径介导的。进一步研究发现，THBS1 与 OTUD5 具有很强的结合潜力，并且在 AMφ - 外泌体处理的 HBMECs 中，THBS1 和 OTUD5 共定位。沉默 OTUD5 会增加与 siTHBS1 - AMφ - 外泌体共培养的 HBMECs 中 GPX4 的泛素化水平。这表明在 CIRI 中，巨噬细胞来源的外泌体中的 THBS1 通过调节 OTUD5 的去泛素化酶活性，影响内皮细胞中 GPX4 的水平。

9. 丹酚酸 B 通过破坏 THBS1 与 OTUD5 的相互作用抑制 GPX4 的泛素化：研究人员通过高通量筛选和分子对接等技术，发现丹酚酸 B（SAB）与 THBS1 具有很强的结合亲和力。分子动力学模拟和细胞热迁移实验（CETSA）进一步证实了它们之间的相互作用。SAB 处理不会改变 THBS1 或 OTUD5 的水平，但能够抑制它们的相互作用，部分抑制 AMφ - 外泌体诱导的 GPX4 泛素化。这说明 SAB 能够通过干扰 THBS1 与 OTUD5 的相互作用来抑制 GPX4 的泛素化。

10. THBS1 抑制联合 SAB 处理改善 tMCAO 小鼠的血脑屏障完整性和神经功能缺损：研究人员通过行为学测试（如黏附去除试验和转角试验）、Nissl 染色、DHE 染色和 Evans blue 染色等方法，发现 THBS1 抑制和 SAB 处理都能够显著改善 tMCAO 小鼠的感觉运动功能和神经元损伤，降低氧化应激水平，改善血脑屏障通透性。而且，两者联合处理的效果比单独处理更好。这表明 THBS1 抑制联合 SAB 处理能够协同增强对 tMCAO 小鼠的神经保护作用。

综合研究结果和讨论部分，这项研究首次揭示了巨噬细胞来源的外泌体中的 THBS1 在 CIRI 过程中的重要作用机制。在 CIRI 期间，巨噬细胞来源的外泌体中的 THBS1 水平升高，并转移到脑血管内皮细胞中，与 OTUD5 相互作用，促进 GPX4 的泛素化和降解，从而诱导内皮细胞铁死亡和血脑屏障破坏，加重脑损伤。而敲低巨噬细胞中的 THBS1 能够显著改善脑损伤。此外，丹酚酸 B 能够有效结合 THBS1，显著减轻 CIRI，增强 THBS1 抑制的脑保护作用。

这一研究成果具有重要的意义。它不仅加深了我们对 CIRI 发病机制的理解，为进一步探索 CIRI 的病理过程提供了新的视角，而且为开发治疗 CIRI 的新策略提供了潜在的靶点和方向。不过，研究也存在一些局限性，比如只关注了 CIRI 急性期巨噬细胞对脑血管内皮细胞的影响，没有研究长期神经功能缺损；只使用了年轻小鼠，没有研究老年小鼠的情况；只研究了巨噬细胞来源的外泌体对脑血管内皮细胞的作用，没有考虑其他脑血管细胞。未来的研究可以针对这些局限性展开，进一步完善对 CIRI 的认识，为临床治疗提供更有效的方法。