《Journal of Neuroinflammation》巨噬细胞外泌体中的 THBS1 如何 “捣乱” 脑血管，丹酚酸 B 又怎样 “力挽狂澜”？

为解决 CIRI 机制不明及缺乏有效治疗手段的问题，哈尔滨医科大学附属第二医院的研究人员探究巨噬细胞来源外泌体对 CIRI 的影响。发现 THBS1-OTUD5-GPX4 轴的作用及 SAB 的保护效果。推荐阅读，助您了解 CIRI 新机制与潜在疗法。

　　

在医学领域，急性缺血性中风（AIS）就像一个可怕的 “健康杀手”，它是由于脑动脉闭塞，导致脑组织瞬间陷入 “能源危机”。目前，治疗 AIS 的主要方法是尽早恢复缺血区域的血流，拯救缺血半暗带的组织。然而，“理想很丰满，现实很骨感”，恢复血流后却会引发二次脑损伤，也就是脑缺血 - 再灌注损伤（CIRI），这严重影响了患者的预后。尽管近年来治疗方法不断进步，但 CIRI 患者的残疾率和死亡率依旧居高不下。这背后的原因在于 CIRI 的病理生理机制十分复杂，其中血脑屏障（BBB）的破坏是关键因素之一。血脑屏障就像大脑的 “忠诚卫士”，它能选择性地过滤物质，对维持中枢神经系统的稳定至关重要。但在 CIRI 过程中，这个 “卫士” 却受到了伤害，内皮细胞结构受损，屏障功能下降，使得血液中的有害物质趁机侵入脑组织，造成损伤。所以，深入探索 CIRI 的分子机制，寻找新的治疗靶点，成了医学研究的当务之急。

同时，铁死亡（一种由铁过载驱动的、以活性氧物种（ROS）过度产生和积累以及脂质过氧化增加为特征的程序性细胞死亡形式）在 CIRI 中的作用也备受关注。研究发现，内皮细胞对铁死亡特别敏感，抑制内皮细胞铁死亡能有效减轻 CIRI，改善患者预后。然而，脑微血管内皮细胞在 CIRI 中的铁死亡调节机制却还是个未解之谜。

另外，巨噬细胞在 CIRI 的病理过程中也扮演着重要角色。它们就像一群 “活跃分子”，在 CIRI 时会大量浸润到脑组织中，而且其分泌的外泌体可以与其他细胞进行 “交流”。已有研究表明，巨噬细胞来源的外泌体可能参与了铁死亡过程，但它们在 CIRI 时对脑微血管内皮细胞的影响及潜在机制，还有待进一步挖掘。

为了攻克这些难题，哈尔滨医科大学附属第二医院的研究人员在《Journal of Neuroinflammation》期刊上发表了题为 “Macrophage-derived exosomal THBS1 promotes endothelial ferroptosis and blood-brain barrier disruption via OTUD5-mediated GPX4 ubiquitination during cerebral ischemia-reperfusion injury” 的论文。研究发现，在 CIRI 过程中，巨噬细胞通过外泌体途径诱导内皮细胞铁死亡和血脑屏障破坏，而血栓反应蛋白 - 1（THBS1）是这一过程的关键因素。此外，丹酚酸 B（SAB）能有效结合 THBS1，增强 THBS1 抑制对大脑的保护作用。这一研究成果为治疗 CIRI 提供了新的方向和潜在策略。

在这项研究中，研究人员运用了多种技术方法。他们建立了小鼠脑缺血 - 再灌注损伤模型和氧糖剥夺 / 复氧（OGD/R）细胞模型，模拟 CIRI 的病理过程。通过超速离心法分离巨噬细胞来源的外泌体，并利用纳米颗粒跟踪分析（NTA）、透射电子显微镜（TEM）等技术对其进行鉴定。还采用蛋白质组学测序、转录组数据分析、单细胞测序等方法筛选关键分子。同时，运用 RNA 干扰、腺相关病毒转染等技术对相关基因进行调控，使用细胞热迁移分析（CETSA）、分子对接、分子动力学模拟等手段研究分子间的相互作用。

下面我们来详细看看研究结果。

1. OGD/R 处理的巨噬细胞条件培养基诱导脑内皮细胞铁死亡：研究人员通过激光散斑对比成像和 TTC 染色，成功确认了小鼠脑缺血 - 再灌注损伤模型的建立。实验发现，随着再灌注时间的延长，血脑屏障完整性逐渐遭到破坏，相关蛋白表达下降，通透性增加，脑水肿也愈发严重。而且，巨噬细胞在 CIRI 后大量浸润到脑组织中，与内皮细胞 “亲密接触”。接着，他们将经过 OGD/R 处理的巨噬细胞条件培养基与人类脑微血管内皮细胞（HBMECs）共培养，结果发现 HBMECs 的屏障相关蛋白水平下降，PI 阳性细胞比例增加，脂质过氧化水平上升，线粒体膜电位降低，铁死亡标记物 SLC7A11 和 GPX4 显著下调。而用外泌体合成 / 分泌抑制剂 GW4869 预处理巨噬细胞后，这些变化得到了明显改善。这表明巨噬细胞可能通过分泌外泌体，介导 HBMECs 的铁死亡和屏障破坏。

2. AMφ 衍生的外泌体诱导脑微血管内皮细胞铁死亡：为了进一步探究巨噬细胞来源外泌体的作用，研究人员从巨噬细胞（Mφ）和模拟 AIS 状态的巨噬细胞（AMφ）的培养基中分离出外泌体。这些外泌体都具有典型的双凹双层膜结构，平均直径约 140nm，并且表达外泌体标记物。免疫荧光染色证实，PKH67 标记的外泌体能被 HBMECs 摄取。CCK8 实验显示，与 AMφ - 外泌体共培养会显著降低 HBMECs 的存活率，而铁死亡抑制剂 ferrostatin - 1（Fer - 1）能有效减轻细胞死亡。此外，AMφ - 外泌体还会下调 HBMECs 的屏障相关蛋白和线粒体膜电位，增加脂质过氧化水平，降低铁死亡相关蛋白水平，而 Fer - 1 处理能部分逆转这些变化。这充分说明 AMφ 衍生的外泌体确实可以诱导脑微血管内皮细胞铁死亡。

3. OGD/R 处理的 RAW264.7 细胞来源的外泌体介导小鼠脑铁死亡：在体内实验中，研究人员对 RAW264.7 细胞进行 OGD/R 处理后，分离出其外泌体，并将 DiR 标记的外泌体通过尾静脉注射到小鼠体内。体内成像和免疫荧光染色发现，外泌体能分布到小鼠大脑中，并被内皮细胞摄取。ELISA 结果显示，接受外泌体处理的小鼠大脑皮质组织中，炎症细胞因子 IL - 6 和 TNF - α 水平升高，血脑屏障破坏更严重，Tunel 阳性细胞增多，超氧阴离子荧光增强，氧化应激标记物水平改变，GPX4 和 SLC7A11 水平下调。这些结果表明，AIS 相关巨噬细胞来源的外泌体在小鼠脑中诱导了铁死亡，加重了脑损伤。

4. 鉴定 AMφ - 外泌体中介导小鼠脑损伤的潜在调节因子：为了找出 AMφ - 外泌体中起关键作用的蛋白，研究人员进行了蛋白质组学测序，并分析了 AIS 相关的数据集。通过一系列筛选和分析，他们发现 THBS1 与内皮功能障碍、炎症调节和氧化应激密切相关，在 AIS 病理过程中可能发挥重要作用。进一步研究发现，THBS1 在 AIS 患者血浆外泌体中显著上调，并且与血脑屏障损伤标记物呈正相关。在临床样本、体内和体外实验中，都验证了 THBS1 在相关细胞和组织中的表达变化。基于这些多层面的分析，研究人员认为 THBS1 是巨噬细胞来源外泌体介导 CIRI 脑损伤的关键调节分子。

5. THBS1 在巨噬细胞来源的外泌体中介导 CIRI 期间内皮细胞铁死亡和屏障破坏：研究人员使用 RNA 干扰技术沉默巨噬细胞中的 THBS1，结果发现这能逆转 AMφ - 外泌体诱导的细胞死亡和氧化应激。与对照组相比，沉默 THBS1 的 AMφ - 外泌体处理的 HBMECs 中，屏障和铁死亡相关蛋白表达增加，线粒体膜电位升高，脂质过氧化水平降低。相反，过表达 THBS1 则会加剧 HBMECs 的氧化应激，降低屏障和铁死亡相关蛋白水平。在体内实验中，沉默 Thbs1 能显著降低小鼠脑血脑屏障的通透性，减少细胞死亡和超氧阴离子水平，上调屏障和铁死亡相关蛋白；而过表达 Thbs1 则会加重相关蛋白的丢失。这些结果表明，THBS1 在巨噬细胞来源的外泌体中，确实介导了 CIRI 期间内皮细胞铁死亡和屏障破坏。

6. 巨噬细胞中 Thbs1 的敲低抑制血脑屏障破坏并减轻脑损伤：为了评估巨噬细胞中 Thbs1 敲低对体内的影响，研究人员使用巨噬细胞特异性腺相关病毒敲低 Thbs1。结果发现，这种方法显著降低了小鼠脑中 Thbs1 的水平，并且没有影响正常脑结构。同时，巨噬细胞特异性 Thbs1 敲低显著改善了血脑屏障通透性，减少了神经炎症和氧化应激，增加了梗死周围脑组织中 CD31?/GPX4?细胞的比例。这说明敲低巨噬细胞中的 Thbs1 能有效减轻血脑屏障破坏和脑损伤。

7. 巨噬细胞来源的 THBS1 通过抑制内皮细胞中的 GPX4 促进 CIRI：研究人员构建了内皮细胞特异性 Gpx4 基因敲除（Gpx4cko）小鼠。实验发现，Gpx4 基因敲除导致小鼠血脑屏障通透性显著增加，屏障蛋白减少。用 AAV - shThbs1 处理 Gpx4?/?小鼠能部分缓解血脑屏障通透性增加和脑损伤，但对 Gpx4cko 小鼠却没有明显改善。这表明巨噬细胞来源的 THBS1 介导的内皮屏障破坏与抑制内皮细胞中的 GPX4 有关。

8. THBS1 通过与 OTUD5 相互作用促进 GPX4 泛素化和降解：进一步研究发现，AMφ - 外泌体处理会显著增加 HBMECs 中 GPX4 的泛素化水平，而敲低 THBS1 能减轻这种现象。用蛋白酶体抑制剂 MG132 预处理 HBMECs，能阻断 GPX4 的降解，说明 GPX4 的减少是通过蛋白酶体途径介导的。蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺（CHX）处理实验表明，AMφ - 外泌体诱导的 GPX4 减少与新蛋白合成无关。虽然 THBS1 与 GPX4 没有直接相互作用，但研究人员发现 THBS1 与 OTUD5（一种参与调节 GPX4 泛素化的关键去泛素酶）有很强的结合潜力，并且通过多种实验证实了它们之间的相互作用和共定位。沉默 OTUD5 会增加与 siTHBS1 - AMφ - 外泌体共培养的 HBMECs 中 GPX4 的泛素化水平。这表明在 CIRI 过程中，巨噬细胞来源外泌体中的 THBS1 通过调节 OTUD5 的去泛素酶活性，影响内皮细胞中 GPX4 的水平。

9. 丹酚酸 B 通过破坏 THBS1 与 OTUD5 的相互作用抑制 GPX4 泛素化：鉴于 THBS1 在 CIRI 中的关键作用，研究人员希望找到能调节 THBS1 的化合物。他们通过高通量筛选天然小分子化合物库，发现丹酚酸 B（SAB）与 THBS1 具有很强的结合亲和力。分子动力学模拟显示，SAB - THBS1 复合物在 5ns 后达到稳定状态。CETSA 实验表明，SAB 处理能增加 THBS1 细胞对降解的抗性。而且，SAB 虽然不改变 THBS1 和 OTUD5 的水平，但能抑制它们的相互作用，部分抑制 AMφ - 外泌体诱导的 GPX4 泛素化。这说明 SAB 通过干扰 THBS1 与 OTUD5 的相互作用，抑制了 GPX4 的泛素化。

10. THBS1 抑制联合 SAB 治疗改善 tMCAO 小鼠的血脑屏障完整性和神经功能缺损：研究人员对 tMCAO 小鼠进行了神经行为学测试，发现 THBS1 抑制和 SAB 治疗都能显著改善小鼠的感觉运动功能，减少神经损伤。而且，联合治疗的效果比单独治疗更好，能更有效地降低氧化应激水平，改善血脑屏障通透性。这表明 THBS1 抑制联合 SAB 治疗对 tMCAO 小鼠具有更好的神经保护作用。

综合研究结论和讨论部分，这项研究首次揭示了巨噬细胞来源的外泌体中 THBS1 在 CIRI 过程中的重要作用机制。THBS1 通过与 OTUD5 相互作用，促进 GPX4 的泛素化和降解，从而诱导内皮细胞铁死亡，破坏血脑屏障，加重脑损伤。而敲低巨噬细胞中的 THBS1 可以显著改善脑损伤，SAB 能有效结合 THBS1，增强 THBS1 抑制对大脑的保护作用。这一研究成果为深入理解 CIRI 的病理机制提供了新的视角，也为开发治疗 CIRI 的新策略提供了重要的理论依据和潜在的治疗靶点，有望为 CIRI 患者带来新的希望。不过，研究也存在一些局限性，比如只关注了 CIRI 急性期巨噬细胞对脑血管内皮细胞的影响，没有研究长期神经功能缺损；实验小鼠年龄单一，未考虑老年小鼠的情况；忽略了脑血管其他细胞的作用；THBS1 与 OTUD5 相互作用的精确细节还不清楚等。未来的研究可以针对这些问题展开，进一步完善对 CIRI 的认识和治疗方法。