OCT4——多能干细胞抗应激 “卫士”，揭秘其翻译调控关键作用

为解决 PSCs 在应激条件下的生存及翻译调控机制问题，研究人员开展 OCT4 相关研究。结果发现 OCT4 是抗应激 RBP，能调控 PI3K/AKT 通路基因翻译。该研究为 PSCs 应用提供理论依据，强烈推荐科研读者阅读。

　　

在生命科学的奇妙世界里，人类胚胎干细胞（hESCs）宛如一颗璀璨的明珠，因其在再生医学领域蕴含的巨大潜力，吸引着无数科研人员的目光。想象一下，如果能掌控 hESCs 的自我更新和定向分化，那对于治疗各种疑难杂症，如器官衰竭、神经损伤等，将是多么令人振奋的突破！然而，目前科学家们虽然在研究 hESCs 在正常培养条件下维持自我更新和多能性（指细胞具有分化成多种不同类型细胞的能力）的分子机制方面取得了不少成果，但仍有一个关键问题像一团迷雾，笼罩在大家心头：当 hESCs 处于压力环境时，它们究竟是如何存活下来的呢？这就好比我们知道一辆车在平坦大道上如何行驶，却不清楚它在崎岖山路上是怎样应对的。

另外，虽然转录后 / 翻译调控对于 hESCs 至关重要，可在外部环境压力（比如缺氧、温度不适宜等）和内部代谢压力（像代谢废物积累、活性氧物质产生等）下，hESCs 如何在翻译水平上协调自身的生存和分化，依旧是个未解之谜。为了揭开这些谜团，科研人员踏上了探索之旅。

作者[第一作者单位] 的研究人员在 [期刊原文名称] 上发表了题为《论文原文标题》的论文。他们经过一系列深入研究，得出了令人瞩目的结论：OCT4（一种由 POU5F1 基因编码的转录因子，在维持干细胞多能性中起关键作用）是一种新型的抗应激 RNA 结合蛋白（RBP），它很可能还是一种内部核糖体进入位点反式作用因子（ITAF）。在压力条件下，OCT4 能够促进 PI3K/AKT 通路相关基因的翻译起始，这些基因对多能干细胞（PSCs）的自我更新和生存至关重要。这一发现意义重大，就像找到了一把钥匙，为深入理解 PSCs 在压力环境下的调控机制打开了新的大门，也为再生医学中 PSCs 的应用提供了重要的理论依据。

为了开展这项研究，研究人员运用了几个关键的技术方法。他们采用交联免疫沉淀 cDNA 文库的高通量测序（HITS-CLIP）技术，来解析人 PSCs 中 OCT4 与 RNA 的相互作用组；通过核糖体新生链复合物结合 RNA 测序（RNC-seq）和 mRNA 测序（RNA-seq）相结合的分析方法，评估 OCT4 在缺氧 PSCs 翻译调控中的作用；还利用蛋白质组学技术，寻找与 OCT4 结合、调节不依赖帽结构的翻译起始的蛋白。此外，他们通过一种名为杂合敲入 N 端标签（HKINT）的方法，研究破坏 OCT4 与 5′-UTR 相互作用对 AKT1 mRNA 翻译的影响。

下面，让我们一起深入了解一下这项研究的具体成果。

OCT4 通过转录后机制正向调节 AKT1 蛋白水平

研究人员之前发现，OCT4 对 AKT1 的转录和翻译存在双重调节机制的线索。在 hECC 细胞系 NCCIT 中，OCT4 蛋白与 AKT1 的启动子结合，抑制其转录。通过 RNA 干扰技术使 OCT4 基因沉默后，AKT1 的 mRNA 水平大幅上升，但蛋白水平却只是略有变化。为了进一步证实和拓展这一结果，研究人员在 hECC 细胞系 NCCIT 以及 hESC 细胞系 H1 和 H9 中，用针对 POU5F1（OCT4）基因的三对 siRNA 干扰 OCT4 的表达。结果发现，OCT4 的 mRNA 和蛋白水平都显著降低，同时 AKT1 的 mRNA 水平明显上调，而蛋白水平则根据 OCT4 沉默的时间和效率，出现略微上调或下调的情况。这表明在 hESCs 中，OCT4 基因沉默会使 AKT1 的 mRNA 水平上升，但蛋白水平相对稳定，说明 OCT4 对 AKT1 的转录和转录后 / 翻译调控之间存在差异。此外，用转录抑制剂放线菌素 D 处理 H9 和 H1 细胞后，发现 AKT1 的 mRNA 水平下降，而蛋白水平在 48 小时内保持不变，这意味着可能存在翻译增强来补偿 AKT1 蛋白的降解。研究人员还通过亚细胞分级分离实验发现，在 H1 细胞的细胞质中存在约 10% 的 OCT4 蛋白，这为 OCT4 参与转录后调控提供了证据。

利用 HITS-CLIP 在体内全基因组解析 OCT4 - RNA 相互作用组

鉴于 OCT4 可能是一种 RBP，研究人员决定利用 HITS-CLIP 技术，全面解析 OCT4 与 RNA 的相互作用组。他们构建了一种 CRISPR/Cas9 编辑的 H1 细胞系（TAP-OCT4 H1 细胞），在该细胞系中，TAP 标签被敲入到内源性 POU5F1 基因座 5′-UTR 之后的位置，以便于分离和富集 OCT4 - RNA 复合物。对 TAP-OCT4 H1 细胞进行 UV 交联，固定蛋白 - 核酸相互作用，然后用 FLAG M2 抗体免疫沉淀 OCT4 - RNA 复合物，经过一系列处理后进行高通量测序。分析结果显示，OCT4 的 CLIP 标签在转录本上的结合范围很广，且在 5′-UTR、编码序列（CDS）和 3′-UTR 区域显著富集，表明 OCT4 优先结合 5′-UTR。通过对 OCT4 结合位点的分析，还发现了富含 GC 的序列（5′-GCCG-3′），这些序列主要存在于 5′-UTR，进一步支持了 OCT4 在 5′-UTR 介导的翻译起始中的潜在作用。

OCT4 与多个 PI3K/AKT 通路基因的 RNA 结合

对 OCT4 结合的靶标进行基因本体（GO）分析，发现其在 RNA 代谢、翻译、各种刺激和应激反应等方面显著富集，这暗示 OCT4 在蛋白质磷酸化、细胞凋亡信号通路和干细胞维持等生理过程中具有重要的调节作用。KEGG 通路分析表明，OCT4 结合的 RNA 富集在多个通路中，包括 PI3K/Akt 信号通路。研究人员发现，OCT4 与多个 PI3K/AKT 通路基因的转录本结合，如 PIK3CD、PIK3R2、PDPK1、AKT1 等，并且结合位点靠近这些基因的 5′-UTR，这表明 OCT4 可能参与这些基因的翻译起始过程。通过 RIP-qPCR 实验，进一步验证了 OCT4 蛋白与部分 mRNA 靶标的结合。

OCT4 与调节不依赖帽结构和 / 或依赖帽结构但不依赖 EIF4F 的翻译起始的蛋白质相互作用

大多数关于 OCT4 蛋白相互作用组的研究主要关注其作为转录因子的核内作用，而本研究聚焦于细胞质中的 OCT4。研究人员采用温和的细胞裂解条件，并对传统方法进行改进，避免添加核酸酶，以富集细胞质蛋白和部分可溶性核蛋白。通过这种方法，他们用抗 FLAG - M2 抗体免疫沉淀 TAP-OCT4 H1 细胞全细胞裂解物中的内源性 TAP-OCT4 蛋白，再用质谱技术鉴定与之结合的蛋白。结果发现，多个与翻译起始相关的蛋白与 OCT4 相互作用，其中包括经典的 ITAF（HNRNPA1）和 EIF3 的重要组成部分 EIF3G。这表明 OCT4 可能参与不依赖帽结构和 / 或依赖帽结构但不依赖 EIF4F 的翻译起始过程，进而调节 PI3K/AKT 通路基因的翻译。

PI3K/AKT 通路基因的 mRNA 通常被 OCT4 和与 OCT4 相互作用的 RBP 结合

在与 OCT4 相互作用的 RBP 中，HNRNPA1 是一种与翻译起始过程密切相关的蛋白。为了验证蛋白质组学数据，研究人员通过 Western blotting 检测了 TAP-OCT4 免疫复合物中的 EIF3G 和 HNRNPA1 蛋白，发现它们与 TAP-OCT4 共免疫沉淀。进一步比较 OCT4、HNRNPA1 和 EIF3G 的 RNA 相互作用组，发现至少有 13 个 PI3K/AKT 通路基因的 mRNA 被这三种蛋白共同结合，且在这些基因的 mRNA 上存在部分重叠或相邻的结合峰，这表明 OCT4、HNRNPA1 和 EIF3G 可能作为翻译起始复合物的一部分，共同调节 PI3K/AKT 通路基因的翻译水平。

OCT4 调节缺氧 hESCs 中 PI3K/AKT 通路基因的翻译比率

缺氧是 hESCs 面临的主要外部压力之一，会影响其分化方向。为了探究 OCT4 在缺氧应激下对 PI3K/AKT 通路基因 mRNA 翻译的动态调节作用，研究人员对转染了对照 siRNA（siNC）或 OCT4 siRNA（siOCT4）的 hESCs 进行了 RNC-seq 和 RNA-seq 联合分析。结果显示，在缺氧条件下，敲低 OCT4 会导致 PI3K/AKT 通路基因的翻译比率下降，而全局基因中只有较少比例出现这种情况。这表明 OCT4 在缺氧应激下，对维持或促进 PI3K/AKT 通路基因的翻译至关重要。GO 和 KEGG 通路分析进一步揭示，OCT4 在调节翻译起始、应激反应、细胞凋亡等过程中发挥着重要作用，且 PI3K/AKT 信号通路在 OCT4 调控的翻译事件中显著富集。

OCT4 促进 AKT1 的 IRES 介导的翻译起始

由于 OCT4 与 AKT1 mRNA 的 5′-UTR 结合，研究人员推测 AKT1 的翻译起始可能由内部核糖体进入位点（IRES）介导。通过模拟 AKT1v1 和 v3 的 5′-UTR 二级结构，发现它们都具有茎环结构，支持了这一推测。利用双荧光素酶报告系统，研究人员发现 AKT1v3 的 5′-UTR 能够促进荧光素酶报告基因的翻译，而 AKT1v1 则不能。此外，在缺氧条件下，用 4E1RCat（一种抑制依赖帽结构翻译的抑制剂）处理细胞，发现它能增加对照细胞中 AKT 蛋白的水平，但在 OCT4 siRNA 转染的细胞中，这种增加作用完全消失。这表明 OCT4 在缺氧条件下，通过促进 IRES 介导的 AKT1 翻译，对维持细胞内 AKT 蛋白水平起着关键作用。

OCT4 促进的 AKT1 翻译对抗缺氧和氧化应激并调节谱系分化

为了进一步研究 OCT4 与 AKT1 mRNA 结合的功能，研究人员采用 HKINT 方法，在野生型 H9 细胞的 AKT1 基因外显子 2 中敲入 TAP 标签，以改变 TAP-AKT1 mRNA 5′-UTR 的二级结构，降低 OCT4 与之的结合。他们获得了几个杂合子克隆，发现这些克隆中 TAP-AKT1 蛋白水平明显低于野生型 AKT1，而 mRNA 水平却较高，说明 TAP-AKT1 蛋白表达的抑制是由于翻译减少。在缺氧应激下，TAP-AKT1/WT AKT1 的比值持续下降，表明 TAP-AKT1 mRNA 的翻译起始受到抑制。此外，这些杂合子克隆对氧化应激更为敏感，更容易发生凋亡，并且在分化实验中，更倾向于向 ectoderm（外胚层）和 endoderm（内胚层）分化，而向 mesoderm（中胚层）分化的能力不变。

在讨论部分，研究人员指出，尽管之前对 PSCs 在正常培养条件下的分子机制研究较多，但对其在压力条件下的生存机制了解甚少。本研究揭示了 OCT4 作为关键的抗应激 RBP，在压力条件下通过调节 mRNA 翻译，促进 PSCs 的生存和自我更新。OCT4 可能通过结合富含 GC 的基序，促进以 PI3K/AKT 通路基因为代表的许多细胞生存基因的 IRES 介导的翻译起始。此外，HKINT 方法为研究特定基因 5′-UTR 的功能和调控机制提供了有力工具，通过该方法发现破坏 AKT1 mRNA 5′-UTR 与 OCT4 的相互作用，会影响 hESCs 对氧化应激的反应和分化方向。

总的来说，这项研究不仅揭示了 OCT4 在 PSCs 中的新功能，还为理解 PSCs 在压力环境下的调控机制提供了重要线索。它为再生医学中 PSCs 的应用奠定了更坚实的理论基础，也为后续研究指明了方向，比如进一步探究 OCT4 作为 RBP/ITAF 和转录因子在不同细胞类型和生理过程中的相对贡献，以及它们之间的协调机制等。相信在未来，随着研究的不断深入，我们对 PSCs 的认识会更加全面，为攻克更多医学难题带来新的希望。