自体 iPSC 衍生细胞：修复关节软骨缺损的新希望

为解决自体 iPSCs 用于软骨修复缺乏大型动物模型研究的问题，威斯康星大学麦迪逊分校的研究人员开展自体 iMSC - Ch 与 BMSC - Ch 修复猪股骨髁软骨的研究，发现 iMSC - Ch 优势明显。推荐阅读，助您了解软骨修复前沿成果！

　　

在关节疾病的治疗领域，寻找理想的细胞疗法来修复受损的关节软骨一直是科学家们努力的方向。关节软骨一旦受损，因其自身修复能力有限，往往会给患者带来长期的痛苦。目前，骨髓间充质干细胞（BMSCs）是研究较多的用于软骨修复的细胞来源。BMSCs 因其具有向软骨细胞分化的能力以及获取相对容易等特点，受到了广泛关注。像临床上常用的微骨折手术，就是利用内源性 BMSCs 的再生能力来修复软骨损伤。然而，这种方法存在诸多弊端，修复后的组织多为纤维软骨，其胶原蛋白 1 型与 2 型比例失衡，蛋白聚糖含量低，使得修复后的关节在承受负荷时表现不佳。而且，BMSCs 还有导致再生组织骨化的风险，这就像给修复之路设置了重重障碍。

与此同时，诱导多能干细胞（iPSCs）的出现为软骨修复带来了新的希望。iPSCs 是通过重编程体细胞获得的，具有类似胚胎干细胞的自我更新和分化能力。它可以分化为包括软骨细胞在内的各种细胞类型，且来源不受限制，还不存在伦理问题。尤其值得一提的是，iPSC 衍生的间充质干细胞（iMSCs）在生成软骨细胞方面展现出独特的优势，有望生成无骨化倾向的新生软骨。不过，之前的研究大多在小鼠、兔子等小动物模型上进行，小动物模型虽然有成本低、易操作等优点，但它们的软骨自我修复能力较强，实验结果很难直接套用到大型动物或人体临床试验中。在大型动物模型中，迷你猪（minipig）的关节软骨在大小、厚度和解剖结构上与人类相似，是研究软骨再生的理想模型。但一直以来，利用自体 iMSCs 修复大型动物关节软骨损伤的研究还比较缺乏，在临床相关的转化动物模型中，使用自体 iPSCs 衍生的治疗性软骨细胞进行关节软骨修复是否具有优势，也尚不清楚。

为了解开这些谜团，来自威斯康星大学麦迪逊分校的研究人员在《Stem Cell Research & Therapy》期刊上发表了题为 “Autologous induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cell-chondrocyte implants for cartilage repair in a porcine model” 的论文。研究人员通过一系列实验，得出了令人振奋的结论：自体 iPSCs 衍生的细胞在修复关节软骨缺损方面具有巨大潜力，iPSC 衍生的软骨细胞与 BMSC 衍生的软骨细胞相比，增殖率更高；自体 iMSC - Ch（iMSC 衍生的软骨细胞）负载的植入物能够促进透明软骨形成，还能改善关节的免疫微环境。这一研究成果为关节软骨修复提供了新的思路和方法，在软骨修复治疗领域具有重要意义。

研究人员在这项研究中用到了多个关键技术方法。首先是细胞培养与诱导分化技术，他们从幼年迷你猪身上获取细胞，诱导生成 iPSCs 和 iMSCs，同时分离出 BMSCs，并诱导这些细胞向脂肪、软骨、骨等不同细胞类型分化。其次是构建细胞 - 支架复合物技术，制造出由纤维蛋白胶和纳米纤维组成的三维支架，并将 iMSCs 或 BMSCs 接种到支架上，诱导形成工程化软骨植入物。另外，还运用了动物实验与评估技术，在成年迷你猪的股骨髁上制造软骨缺损模型，植入不同的细胞或支架进行修复，之后通过多种检测手段，如组织学染色、免疫荧光染色、力学性能测试等，对修复效果进行评估。

下面我们来详细看看研究结果。

1. 迷你猪成纤维细胞来源的 iPSC 的多能性特征：研究人员从 6 只 3 个月大的迷你猪耳朵中分离出成纤维细胞，经过一系列操作将其重编程为 iPSCs。在这个过程中，细胞的形态发生了奇妙的变化，从最初的成纤维细胞形态逐渐转变为 iPSCs 的上皮样形态，16 天后就形成了紧密排列、边界清晰的 ESC 样集落。对这些 iPSCs 进行鉴定时发现，它们不仅碱性磷酸酶（ALP）染色呈阳性，而且多能性标记物的表达显著上调，还具备分化为三个胚层细胞的能力，这表明研究人员成功获得了迷你猪 iPSCs。

2. iMSCs 和 BMSCs 的多向分化能力：将 iPSCs 诱导分化为 iMSCs 后，研究人员对 iMSCs 和 BMSCs 进行了深入研究。从形态上看，二者都呈纺锤形。在细胞生长方面，iMSCs 在短期培养（8 天）时增殖速度更快，长期培养（100 天）时累计的群体倍增数也更多。在分化能力上，它们都能向脂肪、软骨、骨细胞分化，但 iMSCs 表现更优。例如，在脂肪分化过程中，iMSCs 中与脂肪细胞相关的标记物表达更高；在软骨分化时，iMSCs 形成的软骨细胞不表达肥大软骨细胞和纤维软骨细胞的标记物，而 BMSCs 形成的软骨细胞则出现了肥大软骨细胞相关标记物的上调。

3. 工程化软骨植入物在迷你猪股骨髁软骨缺损中的稳固留存：为了给工程化软骨植入物创造合适的 “家”，研究人员专门设计了一种手持套管针工具，在迷你猪股骨髁的负重表面制造出直径 7mm、深度 0.6mm 的标准圆形软骨缺损，并且保证下方的软骨下骨完好无损。随后，将 BMSC 或 iMSC 负载的工程化软骨植入物，以及无细胞的纤维蛋白胶 / 纳米纤维垫植入缺损处，同时设置微骨折技术作为对照组。术后 1 个月的 MRI 图像显示，植入物都稳稳地待在缺损部位。4 个月后进行宏观评估发现，细胞负载的植入物和微骨折组的软骨缺损有部分填充，而无细胞组几乎没有新组织生成。

4. iMSC - Ch 植入物促进股骨髁软骨缺损处透明软骨的再生：通过组织学分析，研究人员发现 BMSC - Ch、iMSC - Ch 和微骨折组都有新组织生成，但 iMSC - Ch 组的再生软骨更多。免疫荧光染色检测软骨相关标记物发现，iMSC - Ch 植入物再生的软骨中 COL2A1 水平显著升高，而 COL1A1 和 COL10A1 几乎检测不到，这表明 iMSC - Ch 植入物促进了透明软骨样组织的再生，而 BMSC - Ch 植入物则形成了含有肥大软骨细胞的纤维软骨。

5. iMSC - Ch 植入物减轻关节炎症：研究人员对接受不同治疗的迷你猪关节微环境中的炎症相关细胞因子进行分析，发现 iMSC - Ch 植入物组的促炎因子水平较低，抗炎因子水平较高，这说明 iMSC - Ch 植入物具有更好的免疫调节作用。在对修复软骨的力学性能进行测量时发现，iMSC - Ch 植入物修复的软骨硬度与 BMSC - Ch 植入物相似，但都低于正常软骨，这意味着虽然 iMSC - Ch 植入物在免疫调节方面表现出色，但在力学性能提升上还有进步空间。

综合研究结果和讨论部分，这项研究意义重大。它首次在大型动物模型中评估了自体 iPSC 衍生的软骨细胞修复关键尺寸软骨缺损的可行性，为未来的临床应用提供了重要参考。研究人员通过使用自体细胞植入和无转基因的细胞重编程技术，有效解决了 iPSC 衍生细胞疗法中免疫原性和致瘤性的安全问题。而且，利用大型动物模型和骨骼成熟的转化模型进行研究，更贴近临床实际情况，为后续临床试验奠定了坚实基础。不过，目前研究也存在一些局限性，比如样本量较小，不同研究结果存在差异等。未来的研究需要进一步优化 iPSC 衍生物的软骨形成潜力，在更大的动物模型中研究其长期效果，以验证其临床可转化性。但无论如何，这项研究都为关节软骨修复的细胞疗法点亮了一盏明灯，让我们看到了未来治愈关节疾病的新希望。