突破关节修复难题：自体 iMSC - Ch 植入物助力猪股骨髁软骨重生

为解决自体 iPSC 衍生物用于软骨修复的研究空白，威斯康星大学麦迪逊分校研究人员开展自体 iMSC - Ch 与 BMSC - Ch 植入物修复猪股骨髁软骨的研究，发现 iMSC - Ch 植入物优势明显。推荐科研读者阅读，助于了解软骨修复前沿成果。

　　

在关节疾病的治疗领域，寻找理想的软骨修复方法一直是科学家们努力的方向。关节软骨一旦受损，自我修复能力十分有限，给患者带来了极大的痛苦。目前，多种干细胞被探索用于关节软骨再生，其中骨髓间充质干细胞（BMSCs）凭借其成软骨能力和获取便利性，成为研究热点，微骨折手术就是利用内源性 BMSCs 修复软骨损伤的临床手段。然而，这种修复方式存在诸多问题，修复后的组织多为纤维软骨，其内部 1 型胶原蛋白与 2 型胶原蛋白比例失衡，蛋白聚糖含量较低，使得关节的力学性能较差，难以承受正常的负荷。而且，BMSCs 还存在促使再生组织骨化的风险，其分化的软骨细胞会表达与肥大软骨细胞相关的标记物，最终走向软骨内骨化，这表明 BMSCs 或许并非透明软骨再生的理想选择。

与此同时，诱导多能干细胞（iPSCs）进入了科学家的视野。它是通过过表达特定因子，将体细胞重编程而来，具备与胚胎干细胞相似的自我更新和分化能力。iPSCs 作为细胞来源，不仅不存在供应限制的问题，还能分化为包括软骨细胞在内的各种细胞类型，而且没有伦理方面的困扰。尤其是 iPSC 衍生的间充质干细胞（iMSCs），在生成新软骨时，有着不发生骨化的优势，被视为软骨再生领域极具潜力的细胞来源。

尽管 iPSCs 在软骨再生方面展现出了希望，但目前仍存在一些关键问题亟待解决。一方面，虽然在小鼠、兔子等小动物模型中，iPSC 衍生物的软骨再生研究取得了一定成果，但小动物模型存在自发软骨修复的情况，这使得研究结果难以在大动物模型或临床试验中重复。另一方面，在大动物模型中，使用自体 iPSCs 衍生的治疗性软骨细胞修复关节软骨的优势尚不明确。因此，开展相关研究，深入探究自体 iPSCs 在软骨修复中的作用，显得尤为重要。

为了攻克这些难题，来自威斯康星大学麦迪逊分校的研究人员在《Stem Cell Research & Therapy》期刊上发表了题为 “Autologous induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cell-chondrocyte implants promote hyaline cartilage formation in porcine femoral condyles” 的论文。研究发现，自体 iPSC 衍生的软骨细胞在增殖能力上比 BMSC 衍生的软骨细胞更胜一筹，且二者在软骨基质生成能力上相当。更重要的是，自体 iMSC - Ch（iMSC 衍生的软骨细胞）负载的植入物能够促进透明软骨的形成，还能改善关节的免疫微环境。这一成果为关节软骨修复提供了新的思路和潜在的治疗策略，为相关疾病的治疗带来了新的希望。

研究人员在此次研究中运用了多种关键技术方法。首先是细胞获取与处理技术，从幼年小型猪的耳朵和髂嵴分别获取成纤维细胞和骨髓，进而诱导生成 iPSCs 和分离出 BMSCs。接着是细胞特性分析技术，运用染色、流式细胞术、定量 PCR 等手段，对细胞的多能性、分化能力以及标记物表达情况进行分析。还有构建细胞 - 支架复合物技术，制备出包含 iMSCs 或 BMSCs 的纤维蛋白胶 / 纳米纤维构建物。最后是动物实验技术，在小型猪膝关节上制造软骨缺损，植入构建物后，通过 MRI、组织学染色、免疫荧光染色等方法对修复效果进行评估 。

下面我们来详细看看研究的具体成果。

1. 小型猪成纤维细胞来源的 iPSC 的多能性特征：研究人员从 6 只 3 个月大的小型猪耳朵中分离出成纤维细胞，通过转染质粒的方式，将其重编程为 iPSCs。在这个过程中，他们观察到细胞形态逐渐发生变化，从最初的成纤维细胞形态，慢慢转变为上皮样的 iPSCs 形态，到第 16 天，出现了紧密排列、边界清晰的胚胎干细胞（ESC）样集落。为了确定这些 iPSCs 是否真的具备多能性，研究人员进行了一系列检测。碱性磷酸酶（ALP）染色显示，iPSC 集落呈阳性，这是多能性的一个重要标志。进一步通过 qPCR 和流式细胞术检测发现，iPSCs 中多能性标记物的表达显著上调，而且超过 95% 的 iPSCs 都对 OCT4、NANOG 和 SOX2 等标记物呈阳性染色。不仅如此，这些 iPSCs 还能成功分化为外胚层、中胚层和内胚层细胞，这充分证明了研究人员成功获得了具备多能性的小型猪 iPSCs。
2. iMSCs 和 BMSCs 的多向分化能力：研究人员利用特定试剂盒将小型猪 iPSCs 诱导分化为 iMSCs，并从骨髓中分离出 BMSCs。通过观察发现，iMSCs 和 BMSCs 在形态上相似，都呈现出纺锤形。在细胞生长方面，iMSCs 在短期培养（8 天）时，增殖速度比 BMSCs 更快，长期培养（100 天）时，累积的群体倍增数也更多。而且，这两种细胞都表达间充质干细胞（MSC）相关的表面抗原，如 CD29、CD44 和 CD90，但不表达造血相关标记物 CD45。在分化能力测试中，iMSCs 和 BMSCs 都能向脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞分化。不过，二者在分化效率和分化过程中的表现有所不同。例如，在脂肪分化过程中，iMSCs 中与脂肪细胞相关的标记物 PPARG 表达增加更为显著，说明其向脂肪细胞分化的效率更高。在软骨分化方面，iMSCs 形成的软骨细胞不会表达与肥大软骨细胞和纤维软骨细胞相关的标记物，而 BMSCs 在软骨分化过程中，会出现 MMP13、RUNX2 和 COL10A1 等肥大软骨细胞标记物水平升高的情况，这表明 BMSCs 有向肥大软骨细胞分化的趋势。
3. 工程化软骨植入物在小型猪股骨髁软骨缺损中的稳固留存：为了给工程化软骨植入创造合适的条件，研究人员专门设计了一种手持套管针工具，在小型猪股骨内侧髁的负重面上，精准地制造出直径 7mm、深度 0.6mm 的圆形软骨缺损，并且保证了软骨下骨的完整性。随后，他们将由 BMSC 或 iMSC 负载构建物制成的工程化软骨植入物，以及无细胞的纤维蛋白胶 / 纳米纤维垫构建物分别植入缺损处，同时设置了微骨折技术处理的对照组。术后 1 个月的 MRI 图像显示，植入物都稳固地放置在目标软骨缺损部位。4 个月后进行宏观评估时发现，细胞负载构建物组和微骨折组的软骨缺损有部分被填充，而无细胞构建物组几乎没有新组织生成，通过 ICRS - I 评分系统量化评估，无细胞组的得分明显低于其他三组。
4. iMSC - Ch 植入物促进股骨髁软骨缺损处透明软骨的再生：通过组织学分析（H&E 染色和 Safranin O/Fast Green 染色）发现，BMSC - Ch、iMSC - Ch 和微骨折组都有新组织生成，部分覆盖了软骨缺损，但 iMSC - Ch 组生成的软骨更多。利用 ICRS - II 评分系统进行定量组织学评估，结果显示 BMSC - Ch 和 iMSC - Ch 组在多个参数上的得分都显著高于微骨折对照组，而且 iMSC - Ch 组在细胞形态、细胞聚集和软骨下骨再生等参数上的得分比 BMSC - Ch 组更高。免疫荧光染色检测软骨相关标记物发现，iMSC - Ch 植入物再生的软骨中 COL2A1 水平显著更高，而 COL1A1 和 COL10A1 几乎检测不到，这表明 iMSC - Ch 植入物能够促进透明软骨样组织的再生，而 BMSC - Ch 植入物则形成了含有肥大软骨细胞的纤维软骨。
5. iMSC - Ch 植入物减轻关节炎症：研究人员对接受不同处理的小型猪关节微环境中的炎症相关细胞因子进行分析，发现细胞植入组的抗炎因子（如 IL1RA、IL4 和 IL6）水平升高，促炎细胞因子 IL18 水平降低，这表明 BMSCs 或 iMSCs 可能具有免疫调节作用。进一步比较两种细胞植入组，发现接受 iMSC - Ch 植入物的小型猪，其体内的促炎因子（如 IFNG、IL8、IL12、IL18 和 TNFA）水平更低，抗炎因子 IL4 水平更高，这说明 iMSC - Ch 可能具有更强的免疫调节能力。在评估修复软骨的机械性能时，研究人员发现 iMSC - Ch 植入物再生的软骨硬度与 BMSC - Ch 植入物相当，但都明显低于正常软骨，这意味着虽然 iMSC - Ch 植入物在免疫调节方面表现出色，但在机械性能提升上还有待加强。

综合来看，本研究评估了自体 iPSC 衍生的软骨细胞修复大型动物模型中关键尺寸软骨缺损的可行性。研究发现，自体 iPSCs 作为治疗性细胞来源具有很大潜力，其衍生的软骨细胞在增殖能力上优于 BMSC 衍生的软骨细胞，并且在软骨基质生成能力上二者相当。同时，自体 iMSC - Ch 负载的植入物能够促进透明软骨的形成，改善关节的免疫微环境，这为关节软骨修复提供了新的方向。不过，目前研究仍存在一些局限性，例如样本量较小，不同研究结果存在差异，而且 BMSCs 本身也存在向软骨内骨化的倾向。未来的研究可以朝着优化 iPSC 衍生物的软骨形成潜力、在更大动物模型中研究其长期效果等方向展开，进一步验证其临床应用的可行性。这项研究成果对于推动关节软骨修复领域的发展意义重大，为后续的临床研究和治疗实践奠定了坚实的理论基础，有望为广大关节疾病患者带来更有效的治疗方案。