揭秘小麦黄色花叶病毒 RNA1 复制调控密码：为作物抗病 “解锁” 新路径

为明确 WYMV 的 3?和 5?非翻译区对 RNA 复制的调控机制，研究人员开展 WYMV RNA1 复制调控研究。结果发现相关蛋白对 NIb 蛋白活性的影响及关键作用位点。该研究为防治 WYMV 病害提供理论依据，值得科研读者一读。

　　

在植物病毒的世界里，小麦黄色花叶病毒（WYMV）可是个 “大反派”，它属于大麦黄花叶病毒属（Bymovirus），在东亚地区，像中国和日本的小麦种植区肆意 “搞破坏”，让小麦产量大幅下降。这病毒一旦入侵小麦，就会开启一系列 “捣蛋” 操作，其中基因组 RNA 复制是它完成 “邪恶计划” 的关键环节。

大多数植物 RNA 病毒都是单链基因组，入侵宿主细胞后，会进行蛋白质翻译、基因组复制和包装，还有移动，就像一场精心策划的 “入侵行动”。而 RNA 病毒基因组复制需要复制酶参与，其中病毒编码的 RNA 依赖的 RNA 聚合酶（RdRp）是 “主角”，不过它也得依靠辅助蛋白和宿主因子的 “帮忙”。复制的启动有两种主要机制，一种是依赖引物的过程，另一种是不依赖引物的过程。简单来说，病毒基因组复制就是以正链 RNA 为模板，让病毒编码的复制酶合成互补的负链 RNA，再以负链 RNA 为模板合成新的正链 RNA，这样就完成了病毒 RNA 的复制。

在这个过程中，基因组 3?端的核心调控元件起着关键作用，它能决定复制的起始。这些调控元件的结构特点各不相同，有的有复杂的二级或三级结构，有的则是短序列，没有明显的高级结构。除了核心调控元件，3?区域还有其他序列和结构特征，它们能增强或减弱复制的调控。5?端序列也不 “闲着”，它会通过与 3?端的长距离 RNA - RNA 相互作用完成 RNA 环化，从而提高复制效率。而且，基因组的 3?末端区域还能通过与 RdRp 相互作用改变自身结构，让某些 RNA 病毒实现翻译和复制之间的转换。

小麦黄色花叶病毒也不例外，它的基因组由两条正单链 RNA 组成，5?端有个共价结合的 VPg 蛋白，3?端有个 poly (A) 尾巴。RNA1 和 RNA2 都能编码多聚蛋白，这些多聚蛋白可以被病毒编码的蛋白酶切割，产生 10 种成熟的病毒蛋白。不同 WYMV 分离株的编码区和 3? UTR（非翻译区，就是基因中不编码蛋白质的区域）核苷酸序列通常有很高的一致性，但 5? UTR 的突变率相对较高。而且，WYMV RNA1 的 5? UTR 在不同分离株之间的同源性比 WYMV RNA2 的更高。

不过，科学家们发现了一些有趣的现象。比如，WYMV 的 3?端缺乏腺苷酸化，而且 3? polyadenylation 在体外对 WYMV RNA 负链的合成有负面影响。在 WYMV RNA1 和 RNA2 的 5? UTR 中还发现了 IRES 元件（内部核糖体进入位点，它能让病毒在没有帽子结构的情况下进行翻译），3? UTR 能协同增强相应 5? UTR 的 IRES 活性。但是，WYMV 的 3? UTR 和 5? UTR 对复制的独立调控机制还不太清楚。

另外，根据一些蛋白的功能推测，WYMV 编码的很多蛋白都和它的复制有关。NIb 蛋白具有 RNA 依赖的 RNA 聚合酶活性，被认为是参与病毒复制的核心蛋白。研究发现，NIb 蛋白能和光诱导蛋白 LIP 相互作用，干扰 ABA 途径，从而促进 WYMV 的感染。VPg 蛋白位于病毒基因组的 5′端，在小核糖核酸病毒中，它可以作为新生病毒 RNA 合成的引物。14 K 蛋白能通过其中央疏水结构域与膜结合，把复制装置固定在内质网膜上，可能参与病毒基因组在体内的积累。P3 蛋白也是影响病毒 RNA 积累的重要蛋白。但是，这些蛋白到底是怎么具体调控 WYMV 复制的，还需要进一步研究。

为了揭开这些谜团，相关研究人员在《Virology Journal》期刊上发表了名为Analysis of the regulatory elements of Wheat yellow mosaic virus RNA1 replication in vitro的论文。他们经过一系列研究，得出了不少重要结论，这对于了解 WYMV 的复制机制，以及防治由它引起的作物病害有着重要意义。

研究人员为了开展这项研究，用到了几个主要关键的技术方法。首先是 PCR 技术，用来扩增 DNA 片段，这些片段可以作为模板制作相应的体外转录本。然后是原核表达和纯化技术，把 WYMV 的 NIb、VPg、14 K 和 P3 蛋白在大肠杆菌中表达并纯化出来。还有体外转录技术，利用 T7 RNA 聚合酶转录出目标 RNA。另外，通过在线探测技术（In - line probing）研究 RNA 的结构，以及体外复制技术来观察病毒 RNA 的复制情况。

下面来看看具体的研究结果。

WYMV NIb 识别 WYMV RNA1 3? UTR 并催化反义 RNA 链的合成

研究人员先在原核细胞中表达并纯化出了 MBP - NIb 融合蛋白。然后选了三个 WYMV RNA1 片段进行体外复制实验。结果发现，MBP - NIb 蛋白能特异性地识别 WYMV RNA1 的 3? UTR，并催化合成其互补链，但是对 WYMV RNA1 的 5? UTR 和中间片段就 “无能为力” 了，而且 MBP 蛋白自己也没办法催化 WYMV RNA1 3' UTR 互补链的合成。

为了进一步验证 WYMV NIb 蛋白的特异性，研究人员又选了其他和病毒 RNA 积累有关的 WYMV 蛋白，像 14 K、P3、VPg，还有烟草丛生顶病毒（TBTV）的 RdRp 来做实验。他们纯化出 MBP - VPg、MBP - 14 K 和 MBP - P3 融合蛋白后发现，TBTV 的 RdRp 不能识别和催化 WYMV RNA1 3? UTR 互补链的合成，14 K、P3 和 VPg 蛋白也没办法独立完成这个任务。这就表明，WYMV NIb 蛋白确实能特异性地识别和催化 WYMV RNA1 3? UTR 互补链的合成。

研究人员还分析了 14 K、P3 和 VPg 蛋白对 NIb 的 RdRp 活性的调控作用。他们发现，有 14 K 和 P3 蛋白存在时，NIb 的 RdRp 活性分别提高了 1.2 倍和 1.5 倍；而有 VPg 蛋白存在时，NIb 的 RdRp 活性降低到了野生型的 80%。当把这些蛋白两两组合再测试时，发现 14 K 和 P3 蛋白一起能让 NIb 的 RdRp 活性提高 2.5 倍，但是 14 K 和 VPg、P3 和 VPg 组合，还有三个蛋白一起组合，对 NIb 的 RdRp 活性都没有明显影响。

WYMV RNA1 3? UTR 的核心结构影响复制效率

为了找到 WYMV RNA1 3? UTR 和 NIb 蛋白相互作用的位点，研究人员用在线探测技术检测了有 NIb 蛋白和没有 NIb 蛋白时 RNA1 3? UTR 的结构变化。他们发现 RNA1 3? UTR 的末端有五个发夹结构（H1 - H5），有 NIb 蛋白存在时，H1 和 H2 之间连接序列中的UU 和 H4 环中的UU 的在线切割减少了，这意味着有新的碱基配对形成。

接着，研究人员通过检测 3? UTR（或其突变体）和 NIb 之间的体外复制情况，来确定它们相互作用的位点。结果发现，和野生型 RNA1 3? UTR 相比，ML4 和 M7624 突变体不能催化相应反义链的合成，H4 茎部的突变（MS4）也让复制效率降低到了野生型的 30%。这说明UU 和UU 可能是和 NIb 蛋白相互作用的位点，而且这两个位点同时存在才能保证复制的进行。

研究人员还对 3? UTR 的 H1、H2、H3 和 H5 进行了突变实验，看看它们对 MBP - NIb 合成互补链有什么影响。结果发现，H1 发夹茎部（MS1）或环（ML1）突变时，MBP - NIb 合成的互补链分别下降到野生型 3' UTR 的 90% 或 70%；H2 发夹的茎部（MS2）和环（ML2）都突变时，MBP - NIb 就没办法用这些模板合成互补链了；H3 发夹茎部（MS3）突变时，MBP - NIb 合成互补链的效率没有明显变化，但是 H3 环（ML3）突变时，互补链合成量下降到了野生型的 70%；H5 的茎部和环（MS5 和 ML5）都突变时，MBP - NIb 合成互补链的量下降到了野生型的 30%。这表明 H2 和 H5 的突变对 MBP - NIb 合成互补链影响很大，可能是因为它们的突变改变了 RNA1 3?端的整体结构，让 NIb 蛋白的结合能力变弱了。

研究人员在讨论部分提到，获得纯化且有活性的复制酶是研究病毒复制调控的关键一步。和从病毒感染细胞中纯化的复制酶相比，用原核表达系统获得的纯化复制酶（比如本研究中的 NIb 蛋白）纯度更高。研究发现，VPg、14 K 和 P3 蛋白在体外不能独立催化病毒基因组复制，但 14 K 和 P3 蛋白和 NIb 蛋白一起时，能增强 NIb 蛋白的复制活性，这说明它们可能和 NIb 蛋白形成了复制复合物，改变了 NIb 蛋白的构象，让它更容易结合 3' UTR，从而影响病毒在体内的积累。而 VPg 蛋白对复制有抑制作用，不过它在 WYMV 复制过程中的具体作用机制还不清楚，因为 WYMV 从负链到正链的转录过程还没研究清楚，后续还需要建立相关转录系统来深入研究。

小麦黄色花叶病在东亚，尤其是中国，是一种对经济影响很大的病害。它最早在 20 世纪 70 年代被发现，之后大面积爆发，还逐渐扩散到了很多省份。目前对小麦黄色花叶病的防治主要依靠小麦的自然抗性和转基因小麦品种。之前对 WYMV 翻译调控机制的研究发现了它 5? UTR 中的 IRES 元件和 3? UTR 对 IRES 活性的协同增强作用，但对 WYMV 复制的独立调控机制了解还不够。

在这项研究中，研究人员发现纯化的 MBP - NIb 蛋白对 RNA1 的 3? UTR 特异性很高，还在 RNA1 3? UTR 末端发现了五个发夹结构（H1 - H5），确定了UU 和UU 可能是和 NIb 蛋白相互作用的位点，它们同时存在对体外复制很重要，而且 H2 和 H5 是体外 RNA 复制的关键发夹结构，它们的突变会影响 NIb 蛋白的结合。虽然这些结果是在体外实验中得到的，但研究人员预测 WYMV RNA1 的全长结构时发现，3? UTR 末端的结构是独立存在的。这些发现为进一步研究 WYMV 在体内的复制调控提供了基础，也有助于找到抗病毒的靶点，为防治 WYMV 引起的作物病害提供了理论依据。