TDP - 43 或成解开肌萎缩侧索硬化症谜团的关键，驱动脊髓运动神经元可逆性过度兴奋

为解决 ALS 患者运动神经元过度兴奋机制不明的问题，研究人员开展 TDP - 43 病理与神经元兴奋性关系的研究，发现其可致脊髓运动神经元严重但可逆的过度兴奋。这为 ALS 治疗提供新方向，值得科研人员一读。

　　

肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis，ALS），这可是一种让人闻风丧胆的致命神经退行性疾病。尽管科研人员们已经努力研究了几十年，但它至今还是个 “无药可医” 的难题。以前，治疗 ALS 的策略非常有限，有一种叫利鲁唑（Riluzole）的药物，它的作用是降低神经元兴奋性。可这药的效果实在不咋地，只能起到一点点作用。这也让大家意识到，兴奋性毒性在 ALS 的发病和进展过程中扮演着重要角色。

科学家们发现，ALS 患者运动网络的兴奋性明显增加，像经颅磁刺激、反射和神经兴奋性研究等都证实了这一点。不过，这里面存在一个大问题：简单地降低神经元兴奋性，根本没办法区分到底是病理性的兴奋性增加，还是运动网络逐渐衰弱时为了维持功能而产生的代偿性（也就是身体为了弥补不足而做出的自我调节）兴奋性增加。这就好比你想关掉一盏坏了的灯，可这盏灯和其他正常工作的灯共用一个开关，你一关，所有灯都灭了，根本分不清哪些灯是好的，哪些是坏的。所以，了解到底是什么在细胞层面导致了病理性的兴奋性变化，就显得尤为重要，因为这有可能带来更有针对性、更有效的治疗方法。

之前，一小部分 ALS 病例被发现和超氧化物歧化酶基因（SOD1）突变有关，基于 SOD1 突变的小鼠模型也为研究提供了一些线索。在这些小鼠模型中，科学家们发现脊髓运动神经元的内在兴奋性增加，还出现了一些结构上的变化，比如轴突起始段（Axon Initial Segment，AIS，神经元产生动作电位的关键区域 ）的长度和直径改变等。然而，SOD1 突变引发的 ALS 病例只占总数的一小部分，大概只有 2%。那么，对于绝大多数散发型的 ALS 病例来说，是什么导致了神经元的过度兴奋呢？这就像一团迷雾，笼罩在科研人员的心头。

后来，大家发现了一个关键的病理特征。在家族性和散发性的 ALS 病例中，一种叫 Tar-DNA 结合蛋白（TDP - 43）的物质出现了异常。正常情况下，TDP - 43 应该待在细胞核里，可在 ALS 患者中，它却跑到了细胞质里，还形成了磷酸化和高度泛素化的聚集体。这个异常现象在大约 97% 的患者身上都能看到。虽然之前有研究用携带 TDP - 43 突变的诱导多能干细胞（iPSCs）培养神经元，发现这些神经元的兴奋性增加，轴突起始段也有变化，但这些细胞还很不成熟，很难推断出它们在成人体内的情况。而且，这些细胞里兴奋性和轴突起始段长度的变化似乎比 TDP - 43 的病理变化出现得还早，这其中的因果关系就变得更加复杂了。

为了弄清楚这些复杂的问题，来自 [作者单位] 的研究人员在《Acta Neuropathologica Communications》期刊上发表了一篇题为 “TDP - 43 pathology drives a reversible hyperexcitability of spinal motoneurones” 的论文。他们通过研究得出了一个重要结论：TDP - 43 的病理变化足以导致脊髓运动神经元出现严重但可逆的过度兴奋。这一发现就像在黑暗中点亮了一盏灯，为 ALS 的研究带来了新的希望。它意味着我们可能找到了一个共同的 “罪魁祸首”，可以解释几乎所有 ALS 患者运动神经元过度兴奋的现象，这对于开发更有效的治疗方法有着重要的意义。

在这项研究中，研究人员用到了几个关键的技术方法。首先是动物实验，他们用两种单基因小鼠进行杂交，得到实验用的双基因小鼠。通过控制饮食中的多西环素（Doxycycline）来调节 TDP - 43 的表达，构建出 ALS 小鼠模型。其次是行为学分析，他们用悬尾实验和抓力耐力测试等方法，观察小鼠的运动功能变化。然后是电生理实验，通过在小鼠体内进行细胞内记录，测量神经元的兴奋性。还有解剖追踪实验和免疫组织化学实验，用来研究神经元的结构变化和标记相关蛋白。最后，利用统计学方法对实验数据进行分析。

下面我们来看看具体的研究结果。

TDP - 43 病理变化导致可逆的 ALS 表型

研究人员通过控制多西环素饮食，成功让小鼠体内的 TDP - 43 按照他们的预期进行表达和变化。当移除多西环素饮食后，小鼠体内的 TDP - 43 从细胞核转移到细胞质，并且出现了磷酸化 TDP - 43（pTDP - 43）的积累。通过对不同组小鼠运动神经元中 pTDP - 43 的定位进行检测，他们发现 tTA 对照组小鼠的 pTDP - 43 主要在细胞核里，而诱导的双基因小鼠在 4 周时，运动神经元中 pTDP - 43 明显从细胞核缺失，转移到了细胞质中，再看那些重新添加多西环素饮食的小鼠，也就是转基因被抑制的小鼠，pTDP - 43 又回到了细胞核里。这一系列变化就像是一场精彩的 “细胞内旅行”，研究人员成功地观察并验证了这个过程。

在运动功能方面，诱导的双基因小鼠出现了严重的问题。才过了 2 周，这些小鼠被悬尾时，后肢就开始出现明显的颤抖和蜷缩现象。到了 4 周，情况更糟糕，它们四肢严重蜷缩，体重急剧下降，肌肉萎缩无力。通过行为学测试，比如抓力耐力测试和转棒实验，研究人员发现这些小鼠的运动功能大幅下降。不过，当重新给这些小鼠喂食含有多西环素的食物，抑制 TDP - 43 的病理变化后，小鼠的运动功能在 6 周后有了显著的恢复。虽然还有点轻微的蜷缩现象，但在抓力耐力测试和转棒实验中的表现，已经和对照组小鼠差不多了，体重也开始回升。这就像是给生病的小鼠吃了一颗 “神奇的药丸”，虽然不能让它们完全恢复如初，但也让它们的情况好了很多。

TDP - 43 病理变化在体内导致病理性运动神经元过度兴奋

为了探究 TDP - 43 病理变化对神经元兴奋性的影响，研究人员进行了电生理实验。他们把微电极插入小鼠体内被逆向识别的脊髓运动神经元中，然后通过微电极向细胞内注入电流，模拟突触输入，记录神经元的反应。结果发现，转基因诱导 4 周后，小鼠运动神经元引发重复放电所需的电流（也就是基强度），比未诱导的双基因对照组小鼠明显降低，差不多低了 74%。这就好比给这些神经元 “打了兴奋剂”，让它们更容易兴奋起来。而当转基因被抑制后，基强度又恢复到了正常水平，tTA 对照组小鼠也证明了这种基强度的降低不是 tTA 表达单独导致的。

随着注入电流强度的增加，研究人员还计算了神经元的瞬时放电频率，得到了神经元的增益。他们发现，诱导组小鼠运动神经元的增益比未诱导组高出 160%，这意味着诱导组的神经元对输入信号的反应更强烈。而且，诱导组小鼠二次放电范围的起始频率比未诱导组和 tTA 对照组都要低很多，这表明诱导组神经元更容易进入二次放电状态。这些变化在转基因抑制后也都恢复到了正常水平。另外，研究人员还发现，不管是快运动神经元还是慢运动神经元，都会受到 TDP - 43 病理变化的影响，出现过度兴奋的情况。这就说明，TDP - 43 的病理变化就像一个 “捣乱分子”，不管是哪种类型的运动神经元，它都不放过，都要让它们变得过度兴奋。

胞体大小减小和输入电阻增加有助于兴奋性增加

为了解释运动神经元兴奋性增加的原因，研究人员开始从神经元的结构入手。他们分析了逆行追踪的比目鱼肌和腓肠肌运动神经元的胞体大小。结果发现，诱导小鼠的腓肠肌运动神经元胞体明显比未诱导的双基因小鼠和 tTA 对照组小鼠小。比目鱼肌运动神经元胞体也有减小的趋势，虽然和 tTA 对照组相比差异不显著，但和未诱导组相比，还是能看出明显的减小。胞体变小可能会导致输入电阻增加，研究人员通过电生理实验验证了这一点。他们给小鼠施加 - 3nA 的超极化脉冲，发现诱导小鼠的输入电阻比未诱导组和 tTA 对照组都显著增加，转基因抑制后又恢复正常。这就好比房子变小了，电阻就变大了，电流通过就更困难了。输入电阻增加还带来了一个副作用，就是超极化激活电流（I_h电流）的激活增加，虽然以整体电压下降的比例来看没有显著差异，但诱导小鼠更大的电压下降导致了更大的绝对 sag（电压下降末端的一个现象）。

轴突起始段变化也与运动神经元兴奋性增加一致

轴突起始段的大小和位置也会影响神经元的重复放电，研究人员自然也不会放过这个关键区域。他们用针对锚蛋白 G（Ankyrin G）的抗体对轴突起始段进行免疫组织化学标记，然后分别向主要由慢肌纤维组成的比目鱼肌和主要由快肌纤维组成的腓肠肌注射不同的示踪剂。结果发现，很多细胞，尤其是腓肠肌运动神经元，轴突丘出现了肿胀，示踪剂都聚集在那里，很难进入胞体。

具体来看，诱导小鼠的腓肠肌运动神经元轴突起始段明显比未诱导组和 tTA 对照组更长。这主要是因为轴突起始段近端边界和轴突丘出现了破坏，有些情况下锚蛋白 G 的标记都延伸到了胞体。同时，诱导小鼠的轴突起始段平均距离胞体更近，但远端边界也更远，说明轴突起始段在近端和远端都发生了伸长。不过，诱导小鼠轴突起始段的远端直径明显比未诱导组和 tTA 对照组小，而且这种缩小在转基因抑制后没有恢复正常。

比目鱼肌运动神经元的轴突起始段在诱导小鼠中也变长了，转基因抑制后恢复正常。但和腓肠肌运动神经元不同的是，比目鱼肌运动神经元轴突起始段到胞体的距离没有明显变化，这说明它的伸长主要发生在远端。而且，比目鱼肌运动神经元轴突起始段的宽度也出现了永久性的减小。综合这些结构上的变化，研究人员认为，胞体变小、输入电阻增加以及轴突起始段的伸长和收缩，都可能导致运动神经元兴奋性增加，这和他们之前的电生理实验结果是一致的。

TDP - 43 病理变化改变单个动作电位

最后，研究人员把目光投向了单个动作电位的特征。他们分析了逆向动作电位，发现诱导小鼠的动作电位幅度明显比未诱导组和 tTA 对照组低，转基因抑制后恢复正常。通过对逆向动作电位进行微分，他们发现诱导小鼠的树突棘动作电位（SD spike）最大上升速率也比对照组低，同样在转基因抑制后恢复正常，但轴突起始段动作电位（IS spike）的最大上升速率没有明显变化。这表明诱导小鼠的胞体和轴突起始段的钠离子通道平衡发生了改变。

此外，研究人员还测量了动作电位后的超极化（AHP）。他们发现，诱导小鼠的 AHP 幅度明显降低，虽然转基因抑制后有所恢复，但没有完全恢复到正常水平，而 AHP 的持续时间则没有明显变化。这一系列结果表明，TDP - 43 的病理变化对动作电位的各个方面都产生了影响。

在讨论部分，研究人员指出，他们的研究结果表明 TDP - 43 病理变化足以导致脊髓运动神经元在体内出现极度的过度兴奋，这和患者身上观察到的兴奋性变化是一致的。而且，这些兴奋性变化和 SOD1 模型中出现的类似，解剖学上的变化，比如轴突起始段的伸长和收缩，在 SOD1 模型的症状期也有报道。这说明运动神经元兴奋性增加可能是家族性和散发性 ALS 的一个关键共同特征，驱动这些内在兴奋性变化的解剖学变化可能在整个疾病中都很常见，尽管最初导致这些变化的因素可能不同。所以，TDP - 43 很可能是解释几乎所有 ALS 患者运动神经元过度兴奋的 “共同凶手”。

不过，研究人员也提到，他们使用的小鼠模型是 TDP - 43 错位的实验模型，ALS 患者体内实际的 TDP - 43 水平是否足以导致显著的兴奋性变化，还有待进一步研究。但他们的结果和之前关于携带 TDP - 43 突变的人类 iPSC 细胞的研究结果相互补充，都表明 TDP - 43 可能是 ALS 中轴突起始段可塑性的上游驱动因素，解释了 ALS 患者下运动神经元兴奋性变化，比如痉挛和肌束震颤等现象。虽然目前还不清楚具体的分子机制，是细胞质 TDP 聚集体的功能获得、细胞核 TDP - 43 缺失的功能丧失，还是细胞核 TDP - 43 功能异常，但这已经为后续的研究指明了方向。

另外，研究人员还发现了近端轴突直径的变化，包括轴突丘的肿胀和轴突起始段的远端收缩。近端肿胀在 ALS 患者的尸检组织中也有发现，可能是由于逆行运输缺陷导致的，TDP - 43 在轴突运输中起着重要作用，携带 ALS 相关 TDP - 43 突变的小鼠中轴突运输就受到了损害。而轴突起始段远端直径变小可能会增加兴奋性，虽然这种变化在重新抑制转基因后没有恢复正常，但可能是正常成熟过程的反映，也可能是大直径运动轴突永久性丧失，由细直径轴突重新支配的结果。

而且，研究人员只研究了脊髓运动神经元，在同样的 TDP - 43ΔNLS 小鼠中，由 CAMKIIα 启动子驱动转基因的上运动神经元也出现了兴奋性增加的情况。如果皮质脊髓运动神经元的轴突起始段也有类似变化，可能就能解释它们的过度兴奋，以及 ALS 患者经颅磁刺激时运动皮层激活阈值降低的现象。

最后，研究人员通过一系列实验验证，发现他们观察到的变化不太可能是由于选择性存活导致的，因为很多测量值都远远超出了正常范围，而且在这个小鼠模型中，即使在疾病诱导后的时间点，细胞损失也很少。更重要的是，几乎所有的变化在转基因抑制、TDP - 43 恢复正常核定位后都是可逆的。这一发现意义重大，目前针对兴奋性的药物，比如利鲁唑，在患者身上效果有限，可能是因为它们无法区分病理性和代偿性的兴奋性变化。而这项研究表明，针对 TDP - 43 进行治疗，可能是一种更安全、更有效的方法，可以将 ALS 患者的神经元兴奋性控制在健康且仍能维持运动功能的水平。这就像找到了一把更精准的 “钥匙”，也许能打开治疗 ALS 的新大门，为众多 ALS 患者带来新的希望。