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为解决植物基因调控现有技术的不足，上海交通大学的研究人员开展 MiRKD 策略研究。结果显示该策略可实现植物基因时空敲低。其意义重大，为作物育种和基因功能研究提供新工具，推荐科研读者阅读。
在植物的世界里，基因就像一个个神秘的指令官，掌控着植物的生长、发育以及应对环境变化的各种 “技能”。科学家们一直渴望能够精准地调控这些基因，就像操控木偶的丝线一样，让植物按照人们的期望生长、产出。在植物功能基因组学研究和作物分子育种领域，修改基因从而获得新功能或者让某些功能丧失，一直是关键的研究方法。
目前，基因下调常用的方法是 RNA 干扰（RNAi），它利用小 RNA 来降解 mRNA 或者抑制 mRNA 的翻译。想象一下，RNAi 就像是给基因的表达 “踩刹车”，让基因产生的蛋白质变少。但这个 “刹车” 不太灵，它存在异位表达、脱靶效应等问题，就好比刹车有时候会在不该刹的地方起作用，而且稳定性和遗传性也不太好，不能稳定地把 “刹车” 的效果传递给下一代。
CRISPR/Cas 系统的出现，给基因调控带来了新希望。基于催化失活的 Cas 变体（dCas）介导的转录抑制的 CRISPR 干扰（CRISPRi）技术，能够精确地调节目标基因，脱靶效应也比较低。然而，它也有自己的 “小脾气”，需要转基因整合并且在多代中持续表达，这在作物育种中就不太方便，就像给植物安装了一个不太好拆卸的装置。后来，CRISPR/Cas 技术的基因编辑克服了一些限制，被广泛用于微调基因表达，比如通过筛选启动子来创造新的种质资源。但筛选理想的突变体既费力又难以预测，而且启动子核心区域的小插入或缺失也会导致基因表达水平大幅变化。
还有一些编辑基因非翻译区来调控基因表达的策略，比如在 5’非翻译区（5’ UTR）整合上游开放阅读框（uORF），或者用引导编辑（PE）技术编辑 ATG 起始密码子上游的 5’ UTR 序列，以及 CRISPR/Cas9 介导删除 3’非翻译区（3’ UTR）的抑制区域来实现基因上调。但这些方法大多只能实现稳定的基因表达调控，却失去了对基因表达时空控制的能力，而时空控制对于研究基因功能至关重要。就好像给植物的基因调控装了一个只能固定模式运行的开关，没办法根据时间和空间的变化灵活调整。
为了解决这些问题，上海交通大学的研究人员在《PLANT COMMUNICATIONS》期刊上发表了题为 “Conditional knockdown of gene expression in plants via 3’ UTR editing” 的论文。他们开发了一种名为 MiRKD（miRNA-mediated in-locus knockdown）的基因组编辑策略，利用内源性 miRNA（微小核糖核酸）来实现作物中基因的时空调控，为作物育种和基因功能研究提供了新的有力工具。
研究人员在这项研究中用到了几个关键技术方法。首先是生物信息学分析，通过分析水稻 miRNA 表达谱，筛选出具有特定表达模式的 miRNA。然后利用双荧光素酶报告系统，快速评估 miRNA 靶序列插入 3’ UTR 对基因表达的影响。此外，还运用了 CRISPR/Cas9 介导的基因敲入技术，将 miRNA 靶序列精准地插入到目标基因的 3’ UTR 中。
下面我们来看看研究的具体结果：
1. MiRKD 平台的设计与开发
研究人员知道，一些植物 miRNA 具有高度特异性的时空和生理表达模式，这就像是植物体内的 “秘密信号”。他们从水稻茎、叶和种子的 miRNA 丰度分析中，找到了 58 个高特异性表达的 miRNA、44 个组成型表达的 miRNA，再加上 12 个报道的根特异性 miRNA，这些都成为了调节基因的候选对象。
为了测试 MiRKD 的可行性，他们建立了双荧光素酶报告系统。把萤火虫荧光素酶（FLuc）当作报告基因，海肾荧光素酶（NLuc）当作内参基因。将组成型表达的 miR156a 的靶序列插入到 GID1、IPK1 和 DET1 基因的 3’ UTR 中，结果发现，与野生型相比，插入 miR156a 靶序列后，这三个基因的 FLuc 表达都显著降低了约 97%。同时，研究人员还发现，把不同 miRNA 靶序列插入 GID1 3’ UTR，只有 miR156a 能降低 GID1 表达，排除了插入行为本身对基因表达的影响。而且，在 GID1 和 IPK1 基因的不同位置插入 miR156a 靶序列，都有显著的敲低效果，靠近终止密码子的位置敲低效果更明显，这说明 MiRKD 可以像一个 “调节旋钮”，精细地调整基因的敲低水平。
2. miR156a - MiRKD 实现组成型敲低
研究人员想看看 MiRKD 在植物体内能不能调节内源基因表达，于是他们先在水稻转基因系中进行实验。用带有 miR156a 靶序列的双荧光素酶质粒转化水稻，结果在 T0 代转基因水稻中，插入 miR156a 靶序列后，FLuc 的表达明显受到抑制。
为了真正实现内源基因表达的敲低，研究人员用之前报道的 CRISPR/Cas9 介导的敲入方法，把化学修饰的 miR156a 靶序列插入到 GID1 基因的 3’ UTR 中。他们得到了 31 株编辑后的 T0 代植株，并从其中 3 株代表性植株获得了 T1 代纯合株系。qRT-PCR 检测发现，这些幼苗中 GID1 的转录水平显著下降了 83% 以上。在 T2 代纯合株系中，miR156a 靶序列的整合不影响 miR156a 本身的水平，而且 GID1 转录水平在不同组织中的敲低效果与 miR156a 的表达水平相关。T1 和 T2 代纯合后代都表现出明显的矮化表型，这表明 miR156a - MiRKD 是一种高效的组成型敲低工具。
3. miR396c - MiRKD 实现空间敲低
组织特异性基因表达对于细胞在不同组织中的功能差异非常重要，就像不同工种的工人在各自岗位上发挥不同作用一样。研究人员选择了主要在茎中中度表达的 miR396c 来展示 MiRKD 在空间敲低方面的能力。
他们先用双荧光素酶质粒在转基因植物中测试，发现 T0 代植株茎中 FLuc 活性下降了 60% 以上。然后用 CRISPR/Cas9 将 miR396c 靶序列敲入 GID1 基因的 3’ UTR，在编辑后的水稻中实现了空间敲低。与野生型相比，miR396c - MiRKD 植株茎中 GID1 转录水平显著降低 30% - 50%，但在叶中没有明显下调。T1 和 T2 代纯合后代也因为 miR396c 对茎组织的作用，表现出中度矮化表型，这说明 MiRKD 能够实现空间特异性的基因敲低。
4. miR528 - MiRKD 实现时间敲低
条件性基因敲低可以对蛋白质功能进行时间上的控制，就像给基因的 “工作时间” 设定了一个定时器。研究人员筛选后选择了在长日照条件下显著上调的 miR528 来评估 MiRKD 在时间敲低方面的应用。
用转基因植物进行双荧光素酶检测发现，长日照处理后，FLuc 活性下降了 95% 以上，而且在短日照条件下，插入 miR528 靶序列反而使 FLuc 活性增加。在编辑后的水稻植株中，长日照条件下，GID1 转录水平在叶片中显著下降 63% 以上，短日照条件下则较高。T2 代纯合的 miR528 - MiRKD 植株在长日照下有轻微矮化表型，短日照下则与野生型相似。虽然 miR528 在短日照下使基因表达升高的机制还不清楚，但这些结果表明 miR528 - MiRKD 可以实现对内源基因的时间控制敲低。
研究人员开发的 MiRKD 平台，通过在目标基因的 3’ UTR 中插入 miRNA 靶序列，实现了对基因表达的条件性调控。他们用 miR156a 实现了组成型敲低，用 miR396c 实现了组织特异性（空间）敲低，用 miR528 实现了时间敲低。而且，MiRKD 敲低效果可以有效遗传给后代，对原始 miRNA 靶基因的表达影响也较小。
此外，研究人员还发现 MiRKD 平台在哺乳动物细胞系中也适用，这大大拓展了它的应用范围。与其他基因调控技术相比，MiRKD 不需要稳定表达外源成分，能保持蛋白质的天然形式，还具有通用性，有可能同时调节多个目标基因，构建复杂的基因表达网络。
不过，MiRKD 也有一些局限性。它主要用于基因敲低，对于基因上调的研究还不够。而且在选择合适的 miRNA 时，需要进行大量的初步验证和筛选，像 miR528 在不同日照条件下对基因表达的影响就比较复杂。
总体来说，MiRKD 为作物育种和基因功能研究提供了一种全新的、强大的工具，让科学家们在探索植物基因奥秘的道路上又前进了一大步。它克服了一些传统基因调控技术的缺点，为未来精准调控植物生长发育、培育优良作物品种带来了新的希望。后续研究可以进一步筛选更多的 miRNA，优化靶序列插入位点，提高敲入效率，让 MiRKD 发挥更大的作用。
