惊！RNA 监测因子 Smg5 竟掌控小鼠颅面发育，Wnt 信号通路背后的秘密被揭开

为解决 Wnt 信号通路在颅面发育中转录后调控机制不明的问题，杭州师范大学等单位的研究人员研究 Smg5 在小鼠颅面发育中的作用。结果发现 Smg5 通过调控 Porcn 影响 Wnt 信号通路。该研究为理解颅面发育机制提供新视角，值得一读。

　　

在神秘的生命科学领域，有一个现象一直困扰着科学家们：腭裂（一种常见的颅面出生缺陷）的发生机制究竟是什么呢？我们知道，颅面神经嵴细胞（CNCCs）在口腔面部发育中起着核心作用，它们就像一群勤劳的 “小工匠”，从神经管的背侧出发，迁移到面部原基，经过增殖和分化，构建出各种各样的颅面结构，比如骨骼、软骨、神经和结缔组织等。在胚胎发育过程中，腭板的生长和融合至关重要，一旦出现问题，就可能导致腭裂。而且，舌头的位置不当、Meckel 软骨的生长异常等也都和腭裂的形成脱不了干系。

研究发现，Wnt 信号通路的改变与腭裂高度相关。像 Wnt5a 在 CNCCs 衍生的间充质中表达，缺少 Wnt5a 或其受体 Ror2 的小鼠，会出现下颌缩短和腭裂的情况。还有，Wntless 基因的缺失、Porcn 基因编码的蛋白功能异常等，都会引发腭裂。可问题来了，在颅面发育过程中，Wnt 信号通路的活性是如何被转录后机制精确调控的呢？这就像一个隐藏在黑暗中的谜团，等待着科学家们去揭开。

为了找到答案，杭州师范大学生命与环境科学学院等单位的研究人员在《iScience》期刊上发表了一篇名为 “Fine - tuning of Wnt signaling by RNA surveillance factor Smg5 in the mouse craniofacial development” 的论文。他们通过一系列研究，发现 RNA 监测因子 Smg5 介导的无义介导 mRNA 降解（NMD，一种依赖翻译的 RNA 质量控制机制，能够降解含有提前终止密码子（PTCs）的 mRNA，维持细胞 RNA 稳态 ）在小鼠颅面发育中有着至关重要的作用，这一发现为解开腭裂等颅面发育异常的谜团提供了关键线索。

研究人员为了开展这项研究，运用了多种技术方法。其中，RNA 测序（RNA - seq）技术可以帮助他们分析基因表达和可变剪接事件；蛋白质免疫印迹（Western blot）能够检测蛋白表达水平；原位杂交和免疫荧光分析则用于观察特定基因的表达情况；TUNEL 检测可识别细胞凋亡情况。这些技术就像是研究人员手中的 “魔法工具”，帮助他们一步步探索颅面发育的奥秘。

下面我们来看看研究的具体结果：

Smg5 缺失导致小鼠腭裂

研究人员将 Smg5 条件性敲除小鼠与 Wnt1 - Cre 小鼠杂交，这样就能让 Smg5 在 CNCCs 衍生的间充质中失活。结果发现，Smg5Wnt1 - Cre 小鼠出现了明显的颅面异常，尤其是下颌特别小，而且 100% 都有完全性腭裂。这些小鼠出生后很快就死亡了，主要原因就是腭裂导致它们无法正常吮吸。通过组织学分析发现，从 E12.5 开始，Smg5Wnt1 - Cre 小鼠的腭板就变形了。到 E14.5，正常小鼠的腭板已经上升到水平位置并开始融合，可 Smg5Wnt1 - Cre 小鼠的腭板却还停留在垂直位置，无法正常生长和融合，导致腭裂。而且，这些小鼠的舌头位置也不对，可能阻碍了腭板的上升。不过，体外腭板融合实验表明，Smg5 缺失并没有影响腭板融合的内在能力，只是延迟了腭板上升的时间。这一系列研究说明，Smg5Wnt1 - Cre 小鼠腭裂的主要原因可能是小下颌以及由此导致的舌头阻塞12。

Smg5 缺乏导致 CNCCs 衍生间充质中的大量细胞凋亡

为了弄清楚 Smg5Wnt1 - Cre 小鼠腭板发育异常背后的细胞缺陷，研究人员进行了 TUNEL 检测。结果发现，在 E13.5 时，Smg5Wnt1 - Cre 小鼠的颅面间充质，包括腭板和下颌，都出现了大量细胞凋亡。在体外培养实验中，他们从 Smg5Wnt1 - Cre 小鼠和对照小鼠的 CNC 外植体中培养 CNCCs，发现随着培养时间的增加，Smg5Wnt1 - Cre 小鼠外植体的绿色荧光强度逐渐降低，这表明从 Smg5Wnt1 - Cre 小鼠 CNC 外植体迁移出来的 CNCCs 发生了细胞凋亡。由此可见，Smg5 对于颅面发育过程中 CNCCs 的存活至关重要34。

Smg5Wnt1 - Cre 小鼠 Meckel 软骨的软骨形成和下颌骨的膜内骨化受损

由于腭裂和小下颌之间存在联系，研究人员对 Smg5 敲除小鼠下颌发育受阻的时间和机制进行了研究。组织学分析显示，Smg5Wnt1 - Cre 小鼠 Meckel 软骨的间充质凝聚延迟。E11.5 时，正常小鼠的间充质细胞在 Meckel 软骨区域聚集，而 Smg5Wnt1 - Cre 小鼠却没有。随着发育进行，Smg5Wnt1 - Cre 小鼠的 Meckel 软骨虽然形成了，但比正常小鼠的细。通过检测软骨细胞的特征标记 Col2a1 和 Sox9，发现它们的表达在 Smg5Wnt1 - Cre 小鼠中显著降低。而且，Smg5Wnt1 - Cre 小鼠的 Meckel 软骨在 E13.5 后尺寸明显减小，到 E18.5 时还没有像正常小鼠那样消失。同时，Smg5Wnt1 - Cre 小鼠下颌骨的骨化也延迟了，E15.5 时正常小鼠下颌骨出现膜内骨化，而 Smg5Wnt1 - Cre 小鼠却没有，到 E18.5 时其下颌骨尺寸也大大减小。这一系列结果表明，Smg5 缺失影响了小鼠下颌发育过程中的细胞分化56。

Smg5Wnt1 - Cre 小鼠的 NMD 活性缺陷

研究人员分析了正常和 Smg5 缺失的下颌骨中一般 NMD 靶标的表达，以此来检测 Smg5 缺乏是否会影响 NMD 功能。通过 RT - PCR 分析发现，在 Smg5 缺失的情况下，含有 PTC 的 NMD 靶标转录本水平大大增加，一些 NMD 靶标转录本的表达也显著上调。这说明 Smg5 在胚胎发育过程中，对于 CNCCs 衍生间充质中的 NMD 至关重要78。

Smg5 缺乏导致发育中的小鼠颅面组织中可变剪接事件改变

研究人员利用 RNA - seq 分析了多个发育阶段的基因表达和可变剪接事件，发现 Smg5 缺乏显著影响了发育中的下颌骨的基因表达和可变剪接。Smg5Wnt1 - Cre 小鼠下颌骨中差异表达转录本（DETs）的数量在 E10.5、E11.5 和 E13.5 都有所增加，而且增加的 DETs 数量至少是下调的 DETs 数量的 3 倍。通过富集分析发现，这些 DETs 大多富集在断奶前致死和器官发生期间的胚胎致死相关基因集，以及 RNA 结合和 mRNA 结合相关的功能中。进一步分析发现，Porcn 基因可能是 Smg5 介导的 NMD 调节小鼠颅面发育的关键靶标910。

Porcn 是 Smg5 介导的 NMD 在调节小鼠颅面发育中的关键靶标

研究人员对 Porcn 基因进行了深入研究，发现 Smg5Wnt1 - Cre 小鼠中 Porcn 基因外显子 3 到 7 的包含水平显著降低，PTC 包含的异构体成为主要表达变体，而编码全长 Porcn 蛋白的正常异构体水平则明显下调。Western blot 分析也表明，Porcn 蛋白水平显著下降，同时 Wnt5a/JNK 信号通路的活性也受到了影响。有趣的是，在体外 CNC 外植体中引入 Wnt5a 重组蛋白，能够明显挽救 Smg5Wnt1 - Cre 小鼠 CNC 的细胞死亡。这一系列研究充分表明，Porcn 是 Smg5 - NMD 在小鼠颅面发育中 CNCCs 衍生间充质的关键靶标1112。

综合以上研究结果，研究人员得出结论：Smg5 介导的 NMD 通过对 Porcn 的转录后调控来微调 Wnt 信号通路，进而调节哺乳动物的颅面发育。在讨论部分，研究人员指出，虽然之前对 Smg5 在 NMD 机制中的作用有所了解，但对其在发育中的相关性却知之甚少。他们的研究首次揭示了 Smg5 在小鼠胚胎发育过程中对 CNCCs 分化的重要性。同时，其他研究也发现 NMD 途径中的关键基因与脊椎动物颅面发育密切相关，这进一步证明了该研究的重要意义。不过，研究也存在一些局限性，比如还没有确定 Smg5 缺陷组织中哪些 RNA 结合蛋白的表达改变导致了 Porcn 表达的失调，以及 Porcn 剪接的变化是 NMD 对单个 RNA 结合蛋白的直接影响，还是多个剪接调节因子复杂相互作用的结果。但无论如何，这项研究为我们理解颅面发育的分子机制提供了新的视角，也为未来相关疾病的研究和治疗奠定了基础，就像在黑暗中点亮了一盏明灯，指引着后续研究的方向。