揭秘罗伊氏乳杆菌：不同菌株对多发性硬化症小鼠模型的影响与潜在治疗意义

为解决 L. reuteri 在小鼠 MS 模型中作用矛盾的问题，阿尔伯塔大学等机构的研究人员开展其菌株对 RR-EAE 小鼠影响的研究。结果发现不同菌株作用差异显著，明确了分子机制。该研究为微生物疗法提供依据，推荐科研读者阅读123。

　　

在医学研究的神秘世界里，多发性硬化症（Multiple Sclerosis，MS）一直是众多科研人员重点关注的对象。这是一种令人头疼的神经退行性自身免疫疾病，就像身体里的 “小怪兽” 在捣乱，巨噬细胞、自身反应性 T 细胞（比如 CD8? T 细胞、CD4?辅助性 T 细胞 1 [Th1] 和 Th17 细胞）以及 B 细胞这些免疫细胞会跑到中枢神经系统（Central Nervous System，CNS）里搞破坏。它们产生的细胞因子、趋化因子和活性氧等物质，会像 “拆迁队” 一样破坏神经髓鞘，导致患者出现各种神经功能障碍。不仅如此，这些 “捣乱分子” 还会破坏血脑屏障（Blood-Brain Barrier，BBB），让外周免疫细胞更容易侵入中枢神经系统，加重病情。

近年来，肠道微生物组逐渐进入了科研人员的视野，大家发现它和 MS 的发展似乎有着千丝万缕的联系。MS 患者的肠道微生物组和健康人存在差异，在小鼠 MS 模型中，肠道微生物组对疾病进展也至关重要。比如无菌小鼠不容易得 MS 相关疾病，但一旦接触特定的微生物群，就可能会发病。然而，目前不同研究关于肠道微生物组和 MS 关系的结果并不统一，而且在人体中也很难确定它们之间的因果关系。

在众多和肠道微生物组相关的研究中，罗伊氏乳杆菌（Limosilactobacillus reuteri）引起了科研人员的浓厚兴趣。它是一种具有免疫调节作用的细菌，在非工业化社会人群的微生物组中含量丰富，因此被看作是治疗慢性疾病的潜力 “选手”。罗伊氏乳杆菌可以刺激调节性 T（Treg）细胞和耐受性树突状细胞的产生，进而调节效应 T 细胞，还能通过产生芳香烃受体（aryl hydrocarbon receptor，AhR）配体来调节免疫系统。AhR 能结合多种化合物，对 Th17 和 Treg 细胞的发育有着重要影响。而且，激活 AhR 在 MS 和实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）中，通常和疾病严重程度降低有关。

不过，罗伊氏乳杆菌在 EAE 小鼠模型中的作用却很矛盾，有时能改善病情，有时又会让病情恶化，这让科研人员十分困惑。由于罗伊氏乳杆菌不同菌株产生 AhR 激动剂的能力不同，科研人员推测这可能是导致其在 EAE 模型中作用差异的原因。为了弄清楚这个问题，来自加拿大阿尔伯塔大学等机构的研究人员在《Cell Reports》期刊上发表了一篇名为 “A secondary metabolite of Limosilactobacillus reuteri R2lc drives strain - specific pathology in a spontaneous mouse model of multiple sclerosis” 的论文。他们通过研究发现，罗伊氏乳杆菌不同菌株对自发复发缓解型实验性自身免疫性脑脊髓炎（Relapsing-Remitting Experimental Autoimmune Encephalomyelitis，RR-EAE）小鼠疾病病理有着显著不同的影响，还找到了相关的分子机制，这一发现为理解微生物与慢性疾病的关系以及选择微生物疗法提供了重要依据 。

研究人员在这项研究中用到了几种关键技术方法。首先是细胞实验技术，利用 H1L6.1c3 报告细胞系来评估罗伊氏乳杆菌不同菌株激活 AhR 的能力。其次是动物实验技术，使用 RR-EAE 小鼠模型，给小鼠口服不同菌株的罗伊氏乳杆菌，观察疾病进展、免疫细胞变化等情况。最后是基因检测技术，通过 RNA 分离和定量聚合酶链反应（qPCR）来分析相关基因的表达，还利用 16S rRNA 测序研究肠道微生物组的变化。

下面来详细看看研究结果：

1. 罗伊氏乳杆菌菌株在体外激活 AhR 的特性：研究人员选取了三种罗伊氏乳杆菌菌株进行研究，分别是 PB-W1、R2lc 和 R2lcΔpks。其中，PB-W1 分离自巴布亚新几内亚农村的个体，R2lc 源自大鼠。R2lc 含有一个独特的质粒，上面的 pks 基因簇能参与合成一种次级代谢产物（芳基多烯化合物），这种化合物可以激活 AhR。实验结果显示，R2lc 是 AhR 的强激活剂，而 R2lcΔpks 由于 pks 基因簇失活，其激活 AhR 的能力大幅下降，和 PB-W1 相当。
2. 小鼠实验设计：为了探究不同菌株在体内的作用，研究人员采用了两种实验方法。他们给 RR-EAE 小鼠每周口服一次 10? CFU 的 PB-W1、R2lc 或 R2lcΔpks，或者给予磷酸盐缓冲液（PBS）作为对照，且治疗在疾病发作前就开始。一组小鼠接受治疗 120 天，用于观察疾病的发作、进展和严重程度；另一组小鼠接受治疗 28 天，用于研究细菌对免疫系统和中枢神经系统的影响，同时避免疾病病理的干扰 。
3. R2lc 在 RR-EAE 小鼠中导致严重疾病病理且依赖 pks 基因簇：经过 120 天的观察，研究人员发现 R2lc 会促进 RR-EAE 小鼠出现严重疾病，疾病评分很高，而且死亡率也更高。不过，当使用 R2lcΔpks 治疗时，疾病评分较低，和 PBS 对照组相似，这表明 R2lc 的致病作用是由 pks 基因簇介导的。相比之下，PB-W1 虽然会使疾病发作时间提前，但疾病症状较轻，且没有小鼠死亡。
4. R2lc 与其他罗伊氏乳杆菌处理组相比降低 RR-EAE 小鼠 AhR 通路基因表达：研究人员分析了接受罗伊氏乳杆菌菌株治疗 28 天的 RR-EAE 小鼠中 AhR 基因及相关调控基因的表达情况。结果发现，与体外实验结果不同，R2lc 处理的小鼠前脑内 AhR、Cyp1b1 和 AhRR 基因表达降低，而 R2lcΔpks 处理组的基因表达情况和 PB-W1 处理组相似。这说明 R2lc 通过 pks 基因簇抑制了 AhR 通路基因的表达。
5. 罗伊氏乳杆菌以菌株特异性方式调节紧密连接蛋白基因表达：血脑屏障完整性降低是 MS 和 EAE 病理的特征之一，AhR 激活可能会调节肠道屏障和血脑屏障。研究人员检测了相关紧密连接蛋白基因的表达，发现 PB-W1 处理的小鼠前脑 occludin 基因表达更高，表明其前脑屏障完整性更好；R2lc 和 R2lcΔpks 处理的小鼠脊髓中 occludin 和 ZO-1 基因表达更高，但这与疾病严重程度似乎没有关联。
6. R2lc 促进抗原呈递髓细胞的扩增：研究人员对治疗 28 天的 RR-EAE 小鼠的免疫细胞进行分析，发现 R2lc 处理的小鼠脾脏中 CD11c?F4/80?单核吞噬细胞数量增加，树突状细胞和巨噬细胞数量也有上升趋势，这表明 R2lc 能促进外周吞噬性抗原呈递髓细胞的扩增。
7. 罗伊氏乳杆菌对 CD4? Th 细胞和 CD8? T 细胞亚群的菌株特异性影响：研究人员发现，所有接受罗伊氏乳杆菌治疗的小鼠脾脏中 CD4? T 细胞数量都比 PBS 对照组多，其中 R2lc 处理组的总 CD4? T 细胞、CD4?效应 / 效应记忆 T 细胞（Teff/Tem）和 CD4?幼稚 T 细胞数量最多。在 CD8? T 细胞方面，R2lc 处理组的总 CD8? T 细胞和 CD8?Teff/Tem 细胞数量比 PBS 对照组多，且 R2lc 处理组的幼稚 CD8? T 细胞数量增加，而 PB-W1 和 R2lcΔpks 组的 CD8?CD44?CD62L?中央记忆 T 细胞（Tcm）比例降低 。此外，R2lc 处理组的 Th17 和 Treg 细胞数量比 PB-W1 或 R2lcΔpks 处理组低。
8. R2lc 促进脾浆细胞和血清 IgM 水平升高：R2lc 和 R2lcΔpks 处理的小鼠血清中总免疫球蛋白 M（IgM）水平升高，这表明这两种菌株可能会导致微生物或微生物产物进入血液，引发全身免疫反应。R2lc 处理的小鼠脾脏中 CD19?CD38?CD138?浆细胞比例和数量显著增加，虽然 PB-W1 也会使浆细胞数量增加，但 R2lc 的这种作用可能依赖于 pks 基因簇 。
9. 罗伊氏乳杆菌抑制外周 IFN-β，R2lc 处理导致前脑 IFN-γ 升高：所有罗伊氏乳杆菌处理组小鼠血清中的干扰素 -β（IFN-β）水平都比 PBS 对照组低，这可能是罗伊氏乳杆菌处理组小鼠 CD4? T 细胞亚群数量增加的原因。R2lc 处理的小鼠前脑 IFN-γ 水平升高，且这种升高可能由 pks 基因簇驱动，因为 R2lcΔpks 处理组的 IFN-γ 水平较低。PB-W1 处理的小鼠前脑角质形成细胞趋化因子（KC）/ 人类生长调节致癌基因（GRO）水平升高，但研究人员并没有确定这些细胞因子升高的具体来源 。
10. PB-W1 和 R2lc 在 RR-EAE 小鼠肠道定植但对肠道微生物群无明显影响：研究人员通过菌株特异性 qPCR 发现，PB-W1 和 R2lc 能够在 RR-EAE 小鼠肠道定植并持续存在，而 R2lcΔpks 定植能力较弱。16S rRNA 测序结果显示，不同处理组小鼠盲肠微生物群在家族、属或操作分类单元（OTU）水平上的相对丰度没有显著差异，补充罗伊氏乳杆菌菌株也没有显著影响这种细菌在小鼠肠道中的丰度，这表明罗伊氏乳杆菌对 EAE 病理的影响不太可能是由肠道微生物群的改变引起的 。

综合以上研究结果，研究人员发现罗伊氏乳杆菌不同菌株对 RR-EAE 小鼠疾病病理有着显著的菌株特异性影响。R2lc 会导致严重的疾病病理，这主要是由其 pks 基因簇引起的。pks 基因簇编码的次级代谢产物在体外是 AhR 的强激活剂，但在体内却有着复杂的作用，可能导致 AhR 信号通路抑制，还会影响紧密连接蛋白基因表达、免疫细胞数量和细胞因子水平等。而 PB-W1 则表现出相对较好的效果，疾病症状较轻且无死亡现象。

这项研究有着重要的意义。它为罗伊氏乳杆菌在 EAE 疾病病理中的菌株特异性作用建立了分子基础，解释了之前研究结果不一致的原因。对于人类 MS 研究来说，它提示了细菌菌株差异可能是导致同卵双胞胎中 MS 发病不一致的原因之一，因为即使是同卵双胞胎，他们的微生物组也存在差异 。在选择用于自身免疫性疾病（如 MS）的益生菌时，研究结果强调了考察细菌菌株特异性作用的重要性。罗伊氏乳杆菌 R2lc 的有害作用表明，即使是被认为有益的菌种，在使用时也难以保证其安全性，益生菌菌株的效果还受到多种因素影响，如宿主遗传易感性等。不过，从 RR-EAE 小鼠的实验结果来看，PB-W1 展现出了一定的安全性和潜在益处，有望成为治疗人类 MS 的益生菌候选菌株 。

总的来说，这项研究为我们深入理解微生物与自身免疫性疾病的关系打开了一扇新的窗户，虽然目前还存在一些局限性，比如实验小鼠模型的饲养困难导致样本量较小等，但它无疑为未来的研究指明了方向，期待科研人员在这个领域能取得更多突破，为攻克多发性硬化症等自身免疫性疾病带来新的希望。