探秘 IGSF3：虽在脑发育中 “登场”，却非大脑发育 “主角”？

为探究 IGSF3 在大脑发育中的作用，威尔康奈尔医学院的研究人员开展 Igsf3 基因功能相关研究，发现 Igsf3 虽在脑内表达，但并非大脑发育必需。该研究有助于深入理解大脑发育机制，值得科研读者一读。

　　

在生命科学领域，细胞粘附分子（Cell Adhesion Molecules，CAMs）是一类十分重要的细胞表面蛋白。它们的胞外区域能通过与相邻 CAMs 或细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM）成分相互作用，促进细胞粘附。免疫球蛋白超家族（Immunoglobulin superfamily，IgSF）便是 CAMs 中的重要一员，它在中枢神经系统发育过程中，对神经元迁移和突触形成等起到关键作用。像 Ncam、L1cam 等 IgSF 家族成员，早已被证实与神经系统发育紧密相关。Ncam 可通过与神经元细胞骨架接触，调节神经突生长和突触形成；L1cam 不仅能调控神经祖细胞群体、神经元成熟，还对轴突生长、动作电位产生及树突分支等有重要影响。

然而，IgSF 家族成员众多，其中 IGSF3 却是一个不太被了解的 “神秘角色”。IGSF3 蛋白由基因编码，它有着独特的结构，包括由八个 V 型免疫球蛋白样结构域构成的胞外区域、疏水跨膜结构域以及胞质 C 末端。而且，由于含有 EWI 基序（Glu - Trp - Ile），IGSF3 属于 EWI 蛋白亚类。之前的研究发现，基因在小鼠出生后小脑的发育过程中受到调控，可能参与颗粒细胞的成熟。同时，它还与一些人类疾病有关，比如在胶质瘤中，IGSF3 能促进疾病进展；在肝细胞癌中，沉默基因会抑制肿瘤生长。但令人遗憾的是，IGSF3 在大脑发育，尤其是新皮质发育中的生理作用，依旧是个未解之谜。

为了揭开这个谜团，来自威尔康奈尔医学院（Weill Cornell Medicine）的研究人员进行了深入探索。他们的研究成果发表在《Scientific Reports》期刊上，论文题目为《Immunoglobulin superfamily member 3 is required for the vagal neural crest cell migration and enteric neuronal network organization》。研究人员通过一系列实验，得出了令人意想不到的结论：Igsf3 虽然在胚胎和出生后的大脑中都有表达，并且与其他 IgSF 蛋白存在共定位现象，但它并非大脑发育所必需的蛋白，在神经元迁移、神经元成熟等过程中，似乎也没有起到关键作用。这一结论对于我们理解大脑发育的机制有着重要意义，它让我们对 IgSF 家族在大脑发育中的作用有了更清晰的认识，也为后续相关研究指明了方向。

研究人员在这次研究中，用到了几个关键技术方法。首先是 CRISPR/Cas9 基因编辑技术，利用它构建了基因敲除（KO）小鼠模型；其次是免疫荧光（Immunofluorescence，IF）和免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）技术，用于检测蛋白表达和定位；还有定量逆转录聚合酶链反应（Quantitative Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction，RT - qPCR）和单细胞 RNA 测序（single - cell RNA sequencing，scRNA - seq）技术，来分析基因表达情况；另外，Sholl 分析则被用来研究神经元树突的分支情况。

下面来看看具体的研究结果：

Igsf3 在发育中的小鼠皮层中的表达

研究人员为了弄清楚在早期皮层发育中的表达情况，将 RT - qPCR 技术和公开的单细胞 RNA 测序数据结合起来。他们从 C57BL/6J（B6）小鼠胚胎和出生后的大脑皮层入手，还利用基于荧光激活细胞分选（FACS）的方法，对不同类型的细胞进行纯化。结果发现， mRNA 主要在神经元祖细胞和分化神经元中被检测到，在多能祖细胞中则没有表达。通过分析公开的 scRNA - seq 数据，研究人员还观察到，从胚胎早期（E11 - E12）开始， mRNA 就在多种细胞类型中表达，并且随着发育阶段的推进，表达模式有所变化。免疫荧光实验进一步显示，在发育中的新皮层中，Igsf3 蛋白在特定区域和细胞类型中表达，而且表达位置和时间与神经元祖细胞的增殖、迁移和分化的阶段和位置相契合。

Igsf3 与免疫球蛋白超家族分子 L1cam 和 Cntn2 在小鼠发育皮层中共定位

IgSF 蛋白在中枢神经系统中存在冗余表达，并且能相互作用。Igsf3 属于 IgSF 家族的第一组，而 L1cam 和 Cntn2 属于第二组。研究人员通过对 E16 皮层进行共染色实验，发现 Igsf3 与 Cntn2、L1cam 在脑室下区（SVZ）和中间区（IZ）细胞中共定位，在边缘区，Igsf3 还与 L1cam 共定位。这表明 Igsf3 与其他 IgSF 家族成员在发育皮层中的表达存在冗余，暗示它可能在皮层发育中发挥作用。

生成基因敲除小鼠模型以解析其在神经元发育中的体内功能

为了探究 Igsf3 对小鼠胚胎发育和皮质发生是否必要，研究人员运用 CRISPR/Cas9 系统构建了基因敲除小鼠模型。他们设计了两个向导 RNA（crRNAs），将其注入单细胞期受精卵的原核中。经过一系列操作，成功获得了基因敲除小鼠。通过基因分型、测序以及免疫荧光、蛋白质免疫印迹等实验，确认了基因敲除的成功以及 Igsf3 蛋白的缺失。而且，成年的基因敲除小鼠外观正常，繁殖能力也未受影响。

Igsf3 对小鼠皮层发育并非必需

考虑到表达的发育调控特点，研究人员想知道敲除该基因是否会导致神经元迁移和皮层组织缺陷。他们对 6 个月大的基因敲除小鼠和野生型小鼠的大脑进行了比较。通过 Nissl 染色、NeuN 染色，以及检测不同皮层层特异性标记物的表达，结果发现，无论是皮层厚度、神经元密度，还是各皮层层的组织和标记物表达，在两种基因型的小鼠之间都没有明显差异。这充分说明，尽管在皮层发育过程中大量表达，但它对皮层发育，包括神经元层的形成和组织，都不是必不可少的。

Igsf3 在出生后海马齿状回中表达，但对神经元成熟并非必需

之前有体外研究表明，Igsf3 可能参与小脑颗粒细胞神经突的形态成熟。研究人员为了验证这一推测在体内是否成立，对比了 60 日龄（P60）的基因敲除小鼠和野生型小鼠的小脑。通过 Nissl 染色、NeuN 和 Calbindin 染色，发现两种小鼠的小脑在大小、叶片形成以及细胞层形态上都没有差异，而且基因敲除小鼠也没有运动缺陷，这意味着小脑的神经回路正常建立。此外，研究人员还发现，在出生后的新皮层中， mRNA 水平大幅下降，但在 P22 时，海马齿状回的颗粒细胞层和分子层仍能检测到 Igsf3 蛋白表达。为了探究 Igsf3 是否影响海马颗粒细胞的树突成熟，研究人员分离并培养了 P1 小鼠的海马神经元，利用 Sholl 分析发现，基因敲除小鼠和野生型小鼠的神经元在近端和远端树突分支数量上没有显著差异。这表明 Igsf3 在神经突发育过程中可能并非必需。

综合以上研究结果，研究人员得出结论：虽然在胚胎和出生后的大脑中呈现出发育调控的表达模式，并且与其他 IgSF 家族成员存在共定位现象，但它对大脑发育，包括大脑皮层神经元的分化、定位和组织，以及小脑和海马神经元的成熟，都不是必需的。

在讨论部分，研究人员提到，IgSF 家族在大脑发育和生理过程中至关重要，但由于家族成员之间表达和功能的重叠，解析它们的具体功能并不容易。IGSF3 在肿瘤进展、细胞迁移等方面已有研究，但在大脑中的功能此前尚未完全明确。此次研究通过多种实验方法，详细分析了 Igsf3 在大脑发育过程中的表达和功能，发现它在大脑发育中并非不可或缺。这一结果可能是因为 Igsf3 与其他家族成员存在功能冗余，也许存在一些补偿机制来弥补它的缺失。

这项研究意义重大，它首次全面地研究了 Igsf3 在大脑发育中的作用，为深入理解 IgSF 家族在神经系统发育中的功能提供了重要依据。虽然研究发现 Igsf3 对大脑发育不是必需的，但这并不意味着它在大脑中毫无作用。未来的研究可以进一步探索 Igsf3 在其他生理或病理条件下的功能，比如在神经系统疾病发生发展过程中的潜在作用，以及它与其他分子之间更复杂的相互作用机制。同时，对于 Igsf3 在胎盘发育和功能方面的作用，也值得进一步研究，毕竟已有研究发现它在胎盘滋养层中有较强表达。