《Nature Reviews Drug Discovery》mRNA 疫苗研究重大突破：新技术解锁 mRNA 质量与功能评估密码

为解决 mRNA 疫苗研发中 mRNA 质量和功能评估难题，研究人员开展基于平台质谱法评估 mRNA 质量与功能的研究。结果显示该方法能检测多种指标。此研究为 mRNA 疫苗研发提供关键技术，强烈推荐科研读者阅读。

　　

在现代医学的发展进程中，mRNA 疫苗成为了一颗耀眼的 “明星”。像辉瑞 - BioNTech 和 Moderna 研发的针对新冠病毒（SARS-CoV-2）的 mRNA 疫苗，成功遏制了疫情的蔓延，让 mRNA 疫苗技术走进了大众的视野，也让人们看到了它在预防多种疾病方面的巨大潜力，比如流感、艾滋病（HIV）和呼吸道合胞病毒（RSV）等疾病。

mRNA 疫苗的原理很巧妙，它由脂质纳米颗粒（LNP）包裹着编码抗原序列的 mRNA。当疫苗进入人体，宿主细胞会 “读取” mRNA 并翻译出抗原蛋白，这些蛋白就像一个个 “信号兵”，刺激人体的免疫系统产生免疫反应，从而帮助身体抵御疾病的入侵。而且，mRNA 疫苗还有很多优点，它易于生产，能够快速更新抗原序列以应对不断变异的病原体，还可以在同一疫苗产品中组合多种不同的 mRNA 构建体。

为了进一步提升 mRNA 疫苗的性能，科学家们还在 mRNA 中加入了修饰的核糖核苷酸，比如 N1 - 甲基假尿苷。它就像是给 mRNA 穿上了一层 “防护衣”，不仅能降低 mRNA 的免疫原性，还能提高其稳定性。凭借这一重要发现，相关研究人员获得了 2023 年诺贝尔生理学或医学奖。不过，随着研究的深入，问题也接踵而至。近期研究发现，N1 - 甲基假尿苷修饰会导致 mRNA 在翻译过程中出现 +1 核糖体移码现象，也就是核糖体在读取 mRNA 时 “跑偏了”，产生了错误的蛋白质。这种错误翻译的蛋白质可能会引发细胞免疫反应，对疫苗的安全性和有效性构成潜在威胁。

此外，在 mRNA 疫苗的研发、优化和生产过程中，如何准确评估 mRNA 的质量和功能也是一个难题。虽然已经有一些分析方法可以检测 mRNA 的部分关键质量属性（CQAs），比如序列一致性、5′ - 加帽效率、3′ 多聚腺苷酸尾长度和 mRNA 完整性等，但这些方法无法全面评估 mRNA 的整体功能，也就是核糖体能否成功翻译出正确的抗原蛋白。而且，现有的检测翻译后蛋白质的方法，如使用抗体的免疫检测方法，存在不少缺陷。比如，开发高特异性的抗体既耗时又昂贵，对于含有多种相似抗原的多价疫苗来说，找到能精准识别每个抗原的抗体更是难上加难。

在这样的背景下，为了解决这些棘手的问题，来自相关研究机构的科研人员在《Nature Reviews Drug Discovery》期刊上发表了一篇名为《A platform - based mass spectrometry approach for the assessment of mRNA quality and functionality》的论文。他们通过一系列研究，成功开发了一种基于平台的质谱检测方法，为 mRNA 疫苗的研究带来了新的曙光。

这项研究主要运用了细胞无细胞翻译（CFT，也被称为体外翻译或无细胞蛋白质合成）和液相色谱 - 串联质谱（LC - MS/MS，文中简称为 MS）这两个关键技术。CFT 就像是在实验室里搭建了一个 “简化版细胞工厂”，能快速评估 mRNA 的功能，避免了脂质纳米颗粒（LNP）递送系统的干扰；而 LC - MS/MS 则如同一个 “火眼金睛”，可以准确识别和定量蛋白质，还能提供蛋白质的序列信息，大大弥补了传统免疫检测方法的不足。

下面我们来详细看看他们的研究成果。

评估 mRNA 功能：通过 CFT - MS 检测翻译后蛋白质的身份和序列确认

研究人员首先用编码 SARS-CoV-2 Delta（B.1.617.2）刺突蛋白的 mRNA 进行实验。他们利用 CFT - MS 工作流程，分别用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或 α - 裂解蛋白酶对翻译后的蛋白质进行消化。结果令人惊喜，使用这三种消化酶，通过 MS/MS 匹配，他们获得了该刺突蛋白 94% 的序列覆盖率；如果把仅质量匹配的情况也考虑进去，序列覆盖率能提高到 99%。这就像是给 mRNA 翻译出来的蛋白质做了一次 “全身检查”，有力地证明了 CFT - MS 能够确保 mRNA 编码出预期的蛋白质序列，还能确认 mRNA 的开放阅读框是否完整翻译，以及终止密码子的位置是否正确。而且，小麦胚芽提取物用于 CFT 还有一个优点，由于反应混合物中缺乏必要的细胞机制，翻译后的蛋白质不会发生糖基化，这使得 MS 分析更加简单。要是使用其他 CFT 系统，如 HeLa 裂解物，则可以评估抗原蛋白上的糖基化模式，因为宿主聚糖的存在会对免疫反应产生很大影响。

评估 mRNA 功能：通过 CFT - SW 和 CFT - MS 检测 mRNA 剂量依赖性蛋白质翻译

接着，研究人员通过改变 mRNA 的浓度，利用 CFT 翻译 SARS-CoV-2 Delta（B.1.617.2）刺突蛋白 mRNA，并用 SW 和 MS 两种方法测量翻译后蛋白质的相对丰度。结果发现，两种方法得到的结果非常相似。在 0 到 13.1 μg/mL 的 mRNA 浓度范围内，蛋白质翻译量与 mRNA 浓度呈现出很强的线性关系；当 mRNA 浓度达到 52.4 μg/mL 时，信号达到最大值；而当 mRNA 浓度继续升高时，信号反而下降。这表明，在无细胞翻译中，增加 mRNA 浓度并不会一直带来更多的蛋白质翻译，就像往一个杯子里倒水，倒到一定程度后，再怎么倒也装不下更多的水了。而且，通过使用不同灵敏度的抗体进行实验，排除了检测信号饱和对结果的影响。这个剂量曲线不仅展示了 CFT - SW 和 CFT - MS 两种工作流程都能准确、可重复地获取 mRNA 翻译蛋白质的相对丰度信息，还帮助确定了每个检测方法的线性范围。

评估 mRNA 质量：使用 CFT - SW 和 CFT - MS 作为稳定性指示测定

在 mRNA 疫苗的研发过程中，评估 mRNA 的质量和稳定性至关重要。研究人员将 SARS-CoV-2 Delta（B.1.617.2）mRNA 在 50°C 下孵育，并在不同时间点取样。他们一方面用微芯片毛细管电泳（MCE）测量 mRNA 的完整性，另一方面用小麦胚芽 CFT 结合 SW 或 MS 检测来评估 mRNA 在各个时间点的功能。结果显示，随着 mRNA 的降解，翻译后蛋白质的量（相对于未降解的时间点 t = 0）也相应减少。这就好比 mRNA 是一台机器的 “设计蓝图”，蓝图受损了，按照它制造出来的 “零件”（蛋白质）自然也会减少。这表明，CFT - SW 和 CFT - MS 工作流程中翻译后蛋白质的相对丰度确实可以作为评估 mRNA 质量和功能的稳定性指示测定。如果需要绝对定量完全翻译的蛋白质，还可以采用针对 C 末端的质谱方法，如单反应监测（SRM）或多反应监测（MRM）。

评估 mRNA 功能：通过 CFT - SW 和 CFT - MS 评估具有高翻译后蛋白质序列同源性的多价 mRNA 混合物

病毒的不断变异给疫苗研发带来了巨大挑战，多价 mRNA 疫苗成为了应对这一挑战的有力武器。然而，多价疫苗中编码的抗原往往具有很高的序列相似性，这给分析工作带来了困难。以 SARS-CoV-2 的 Delta（B.1.617.2）和 Omicron（B.1.1.529）毒株的刺突蛋白为例，它们的序列同源性超过 97%。使用 CFT - SW 检测时，由于抗体的交叉反应，很难选择性地检测出特定的抗原。比如，本应特异性识别 Omicron 刺突蛋白的抗体，对 Delta 样本也会产生微弱的信号；同样，针对 Delta 刺突蛋白的抗体，也会在 Omicron 样本以及空白对照样本中产生信号。

而 CFT - MS 则展现出了强大的优势。研究人员将 Delta 和 Omicron 毒株的刺突蛋白 mRNA 按不同比例混合，然后进行 CFT - MS 分析。结果发现，检测到的 Delta 和 Omicron 刺突蛋白的相对丰度与理论混合比例非常吻合。这就像是 CFT - MS 有一双 “精准的眼睛”，即使在抗原序列高度相似的情况下，也能准确分辨出不同的蛋白质，克服了基于抗体分析方法在检测多价 mRNA 混合物时的局限性，为多价 mRNA 疫苗的分析提供了更可靠的手段。

评估 mRNA 功能：通过 CBT - MS 评估人细胞中配制的多价 mRNA 药物产品的 mRNA 功能

虽然 CFT - MS 在早期评估 mRNA 质量和功能方面表现出色，但细胞内的环境更加复杂，脂质纳米颗粒（LNP）递送系统也会对 mRNA 的翻译产生影响。因此，研究人员利用人细胞系（Huh7）进行了实验。他们用两种不同剂量（每个 mRNA 分别为 6.67 ng 或 4.44 ng）的六价 mRNA 药物产品转染细胞，该药物产品中的六种 mRNA 分别编码不同的刺突蛋白，且这些刺突蛋白的序列同源性在 22 - 97% 之间。

实验结果清晰地证实了六种 mRNA 构建体都成功翻译出了蛋白质，并且蛋白质的翻译量与 mRNA 的剂量相关，剂量越高，翻译出的蛋白质越多。不过，在同一 mRNA 剂量下，不同蛋白质的翻译量似乎存在差异，这就需要进一步进行绝对定量来确认不同 mRNA 构建体之间的翻译效率差异。未来的研究还将深入探讨多价性对 mRNA 翻译效率的影响，并建立基于细胞的效价测定方法，这对于优化多价疫苗的设计和生产具有重要意义。

评估翻译保真度：通过 CFT - MS 识别脱靶蛋白质翻译并表征 +1 核糖体移码位点

使用修饰的核糖核苷酸虽然能提升 mRNA 的稳定性和降低免疫原性，但它对 mRNA 翻译保真度的影响还存在许多未知。之前有研究发现，N1 - 甲基假尿苷修饰的 mRNA 在 “滑序列” 处会出现 +1 核糖体移码现象，这种意外的移码会改变蛋白质的序列。例如，使用 N1 - 甲基假尿苷的 BNT162b2 SARS-CoV-2 mRNA 疫苗，在小鼠和人体内都引发了对 “错误翻译” 蛋白质的脱靶免疫反应。

在本研究中，研究人员使用的 Delta（B.1.617.2）刺突 mRNA 序列中存在可能导致 +1 核糖体移码的位点。通过 CFT - MS 分析，他们不仅检测到了正常翻译的蛋白质，还发现了 +1 移码的蛋白质，其相对丰度约为正常翻译蛋白质的 7%，与之前报道的 N1 - 甲基假尿苷修饰的萤火虫荧光素酶 +1 移码的情况相符。研究人员还通过靶向 MS 分析，进一步确认了 +1 移码产物的存在，并确定了移码发生的氨基酸连接点。与之前的研究方法相比，CFT - MS 工作流程更加高效，能够更全面地检测 +1 移码产物并识别相应的 mRNA 连接点。

综合来看，这项研究意义重大。研究人员开发的基于平台的质谱检测方法，无论是与细胞无细胞翻译（CFT）还是细胞翻译（CBT）相结合，都能为 mRNA 疫苗的研发提供关键信息，包括翻译后蛋白质的身份、mRNA 的质量、翻译效率和保真度等。这一技术就像是为 mRNA 疫苗研发打造了一套 “精密检测仪器”，让科研人员能够更深入地了解 mRNA 疫苗，及时发现问题并进行优化。它不仅有助于加快 mRNA 疫苗在早期研发阶段的进程，在发现新病原体和开展早期临床试验时也能发挥重要作用。而且，随着自动化技术的发展，这种检测方法有望在符合药品生产质量管理规范（GMP）和质量控制（QC）标准的实验室中广泛应用，推动 mRNA 疫苗技术迈向新的高度，为人类健康事业带来更多的希望。