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为解决 eccDNA 在健康组织的形成机制及衰老影响问题，丹麦哥本哈根大学研究人员开展小鼠 eccDNA 相关研究，发现其与转录关联及不随衰老积累的结果。推荐阅读，助您了解基因研究新进展。
在细胞的微观世界里，有一种神秘的物质 ——eccDNA（染色体外环状 DNA），它如同隐藏在基因组中的 “神秘拼图”，一直吸引着科学家们的目光。eccDNA 是真核细胞中一种潜在的不稳定遗传变异来源，它可以来自基因组的各个区域，包括基因片段、完整基因以及基因间区域 。它在癌症的发展进程中扮演着极为重要的角色，当致癌基因存在于 eccDNA 中时，就如同被赋予了 “超能力”，能够快速增加自身的拷贝数和表达水平，进而推动肿瘤的演变和发展。
然而，在健康组织中，eccDNA 的形成机制却如同迷雾一般，让人捉摸不透。随着生物体的衰老，基因组的稳定性会逐渐下降，像单核苷酸变异（SNVs）和插入缺失（indels）这类 DNA 突变会不断累积，甚至会导致哺乳动物组织出现特异性的变化。但令人疑惑的是，目前人们还不清楚 eccDNA 的基因组负担是否会随着哺乳动物的衰老而增加。而且，虽然已有研究表明转录可能对 eccDNA 的形成有影响，但这种影响在健康的哺乳动物组织中究竟是怎样的，依旧是个未解之谜。
为了揭开这些谜团，来自丹麦哥本哈根大学的研究人员在《Nature Communications》期刊上发表了一篇题为 “An atlas of extrachromosomal circular DNA in healthy mouse tissues reveals links to transcription and aging” 的论文。通过深入研究，他们发现 eccDNA 的形成与转录水平之间存在紧密的联系，并且发现随着小鼠年龄的增长，eccDNA 的总量并不会增加。这一发现为我们理解基因进化的机制提供了新的视角，也为后续研究 eccDNA 在癌症和其他疾病中的作用奠定了重要基础。
在这项研究中，研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：首先，他们对 Circle-Seq 协议进行了优化，以此来纯化 eccDNA；其次，通过 CRISPR-Cas9 系统和外切核酸酶去除线粒体 DNA 和线性 DNA，从而富集 eccDNA；然后，利用滚动圆扩增技术和高通量测序技术对 eccDNA 进行扩增和测序；最后，借助生物信息学分析方法，对测序数据进行处理和分析，进而探究 eccDNA 与转录、衰老之间的关系 。
下面让我们一起深入了解一下这项研究的具体结果：
- 构建健康小鼠 eccDNA 图谱：研究人员从不同年龄的野生型 C57BL/6NRj 雄性小鼠的 7 种组织（包括大脑的皮层和海马体、腹股沟皮下脂肪组织、附睾内脏脂肪组织、肝脏、胰腺和骨骼肌）以及胚胎组织中提取样本。为了获得纯净的 eccDNA，他们可谓是 “大费周章”，不仅利用 CRISPR-Cas9 系统线性化线粒体 DNA，还使用外切核酸酶去除线性 DNA，之后再进行扩增和测序。经过一系列复杂的操作，他们成功检测到了 567,963 个高可信度的 eccDNA。这些 eccDNA 的大小不一，平均大小为 4786.5bp，而且在大小分布上呈现出明显的周期性。研究人员还发现，虽然随着小鼠年龄的增长，eccDNA 的数量并没有显著差异，但大脑组织似乎在各个年龄段都含有更多的 eccDNA，不过这种差异在胚胎期才接近统计学意义。此外，他们还估算出每个细胞核平均含有 45 个独特的 eccDNA。同时，研究表明染色体产生 eccDNA 的数量与其长度呈线性比例关系，基因产生 eccDNA 的数量也与基因长度呈线性相关 。
- eccDNA 形成与转录的关联：为了探究转录对 eccDNA 形成的影响，研究人员对匹配样本的 RNA 进行了纯化和分析。以肝脏样本为例，他们通过主成分分析（PCA）发现，肝脏的转录组会根据年龄聚类，并且随着年龄的增长，转录组的分布变得越来越宽泛。同时，eccDNA 的图谱也会随着肝脏的衰老而变得越来越不同。进一步的分析发现，在肝脏中，80 - 90% 在 eccDNA 图谱上映射的基因和基因片段都能检测到 RNA，这表明 eccDNA 的形成具有组织特异性，并且与转录之间存在关联。通过相关性分析，研究人员发现基因转录水平与 eccDNA 形成率之间存在明显的正相关关系，不过这种关系呈现出分段性。在转录水平较低时，eccDNA 的数量与转录水平的增加并无关联；而当转录水平较高时，eccDNA 的数量会随着转录水平对数增加 。此外，他们还发现这种两阶段的相关性在其他组织（如海马体、皮层、肌肉、皮下脂肪组织和内脏脂肪组织）中也存在，而且在不同组织中，转录导致 eccDNA 对数增加的阈值会随着年龄而变化。研究人员还证实，转录与不同大小的 eccDNA（小于 2000bp 和大于 2000bp）的形成均相关。通过置换分析，他们发现 eccDNA 与开放染色质、表达基因等存在正相关关系，但这种关系在 22 个月大的小鼠肝脏中大多消失，只有 H3K36me3 组蛋白标记在所有年龄段都与 eccDNA 相关 。
- 富含内含子且有多种剪接形式的基因对 eccDNA 形成的抵抗作用：研究人员试图找出哪些转录基因更容易或更不容易受到 eccDNA 形成的影响。他们通过分析发现，在肝脏中，有一些基因在转录时始终受到保护，不易发生环化形成 eccDNA。进一步研究这些基因的特征后发现，它们具有更多的外显子、更高的内含子密度以及更多的转录本异构体。在其他组织（如海马体、皮层、肌肉、皮下脂肪组织和内脏脂肪组织）中，也存在大量这样的基因，这些基因的功能往往与所在组织的功能相关。这表明富含内含子且有多种剪接形式的基因能够抵抗转录诱导的 eccDNA 形成事件，这一发现对于维持基因的稳定性和组织的内稳态具有重要意义 。
综合这项研究的结果和讨论部分，我们可以看到它具有多方面的重要意义。在衰老方面，与其他随着年龄积累的突变（如 SNVs 和 indels）不同，eccDNA 在健康组织中并不会随着年龄的增长而积累，这一发现挑战了以往人们对基因组变化与衰老关系的认知，为研究衰老过程中的基因组稳定性提供了新的方向。在转录与 eccDNA 形成的关系上，研究揭示了转录水平对 eccDNA 形成的重要影响，特别是在高转录水平下，eccDNA 的水平会对数增加，这为理解基因表达调控和基因组变异之间的关系提供了关键线索 。此外，研究还发现富含内含子且有多种剪接形式的基因能够抵抗 eccDNA 的形成，这暗示了这些基因结构特征在保护基因组稳定性方面的重要作用，或许在生物进化过程中，这种基因结构的形成就是为了减少 eccDNA 产生过程中可能带来的有害突变 。
这项研究为我们打开了一扇了解 eccDNA 世界的新窗口，让我们对健康组织中 eccDNA 的形成机制以及它与转录和衰老的关系有了更深入的认识。不过，目前的研究结果大多是相关性的，未来还需要更多的实验来进一步探究其中的因果关系。相信随着研究的不断深入，我们将能够更加全面地揭示 eccDNA 的奥秘，为癌症和其他相关疾病的研究和治疗带来新的突破和希望。
