揭秘膀胱癌中 p53 突变奥秘，构建创新小鼠模型助力免疫抗癌研究

为解决膀胱癌研究中机制不明、模型缺乏等问题，研究人员开展关于膀胱癌中 p53 突变及相关机制的研究。结果发现 p53 突变 LOH 等关键机制并建立新小鼠模型。该研究为膀胱癌研究提供新思路与工具，推荐科研读者阅读。

　　

探秘膀胱癌：科学家如何解锁关键机制并建立创新模型

在 2020 年，膀胱癌成为全球第十大常见癌症，如同隐藏在人体内部的 “定时炸弹”，悄无声息地威胁着人们的健康。当年，新增病例高达 57.3 万，21.3 万人因此失去生命。大多数膀胱癌在病理上被归类为尿路上皮癌，又可细分为非肌肉浸润性膀胱癌（NMIBC）和肌肉浸润性膀胱癌（MIBC）。其中，MIBC 约占膀胱癌病例的 25%，可别小瞧这个比例，对于那些患有局部浸润性疾病和转移性疾病的患者来说，5 年生存率分别只有 50% 和 15% ，情况不容乐观。

尽管免疫检查点抑制剂，像针对程序性细胞死亡 1（PD - 1）/ 程序性细胞死亡配体 1（PD - L1）的药物，已获批用于晚期膀胱癌的治疗，但它的有效率仅为 20 - 30%，就像一把不太锋利的 “抗癌宝剑”，无法斩尽所有癌细胞。之所以会这样，很大程度上是因为我们对膀胱癌的发生机制以及它的免疫逃逸机制了解得还不够透彻。这就好比我们在黑暗中摸索，找不到前进的方向，使得研发更有效的治疗方法变得困难重重。

在膀胱癌的众多突变中，p53 突变最为常见，超过 60% 的突变是错义突变。可奇怪的是，虽然有很多关于 p53 基因敲除的小鼠模型研究，但涉及 p53 错义突变的原发性膀胱癌小鼠模型却几乎没有。同时，除了 p53 和细胞周期相关基因，RTK - RAS - PI3K 通路以及表观遗传学相关基因突变在人类 MIBC 中也起着重要作用，比如 PTEN 拷贝数丢失在 MIBC 中很常见，但我们对它们的了解还远远不够。此外，之前研究发现细胞角蛋白 5（Krt5）阳性的尿路上皮细胞可能是基底亚型 MIBC 的起源细胞，可想要在尿路上皮中特异性地诱导突变却困难重重，就像在错综复杂的迷宫中寻找特定的路径，阻碍重重。

为了攻克这些难题，研究人员在《Nature Communications》期刊上发表了题为 “Trp53 mutant LOH drives bladder carcinogenesis and enables the generation of an immunocompetent mouse model” 的论文。研究发现，p53 错义突变伴随杂合性缺失（LOH，即丢失 p53 野生型等位基因）以及 PTEN 功能缺失在膀胱癌发生中具有重要意义。同时，他们还建立了一种新的免疫健全的小鼠模型，这为膀胱癌的研究提供了强有力的工具，仿佛给黑暗中的探索者点亮了一盏明灯。

在这项研究中，研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：首先是全外显子测序（WES），它就像基因的 “放大镜”，能帮助研究人员分析人类和小鼠 MIBC 肿瘤组织中的基因，找到潜在的驱动基因；基因编辑技术（CRISPR/Cas9 系统），如同基因的 “剪刀”，可以对特定基因进行精准编辑，改变基因的功能；还有数字 PCR 技术，它能够精确地检测基因拷贝数的变化，为研究基因的改变提供准确的数据支持。

下面来看看具体的研究结果：

1. 建立 Trp53 突变 K5 - mUrorganoids 小鼠膀胱癌模型：研究人员通过对人类和小鼠 MIBC 肿瘤组织进行 WES，发现除了 p53 突变外，KMT2C 改变也很常见。基于此，他们利用基因工程小鼠的类器官，建立了膀胱癌小鼠模型。他们给 Krt5^CreERT2/+; Rosa26^{LSL - Cas9 - EGFP}; Trp53^{LSL - R172H/+}小鼠注射他莫昔芬，让膀胱尿路上皮中表达 Krt5 的细胞（包括基底细胞和中间细胞）表达 Cas9、R172H 突变型 p53 和 EGFP。7 天后收集尿路上皮细胞并培养成类器官（Trp53^R172H/+ K5 - mUrorganoids）。接着用表达 sgKmt2c 和 sgPten 的 AAV 感染这些细胞，利用 CRISPR/Cas9 系统进行基因编辑。结果发现，Trp53^R172H/+; Kmt2c - KO; Pten KO K5 - mUrorganoids 细胞通过皮下、原位和肾包膜下注射，能在无胸腺小鼠中形成肿瘤，且这些肿瘤的组织学特征与人类 MIBC 伴鳞状分化的肿瘤相似。进一步研究还发现，肿瘤来源的类器官（TuOrs）丢失了野生型 Trp53 等位基因，发生了 LOH，而且 Trp53 突变等位基因比例在肿瘤发生过程中逐渐增加，这表明野生型 Trp53 等位基因的丢失有利于 Trp53 突变的 K5 - mUrorganoids 细胞肿瘤发生。
2. p53 杂合性缺失在人类 MIBC 中很常见且与肿瘤发生相关：研究人员分析 TCGA 数据发现，在人类 MIBC 样本中，TP53 是最常发生改变的基因，其中 74%（占总病例的 33%）的患者存在单核苷酸改变伴 LOH。虽然 TP53 状态与患者的总生存期、亚型、疾病阶段或病理 T 阶段没有相关性，但这一结果提示研究 p53 突变伴 LOH 在 MIBC 发展中的功能意义具有临床相关性。
3. Trp53 野生型等位基因丢失和 Pten 缺失赋予 K5 - mUrorganoids 在无胸腺小鼠体内的致瘤能力：研究人员构建了八种不同基因型的 K5 - mUrorganoids，通过体外和体内实验进行研究。结果发现，Trp53^Δ/Δ K5 - mUrorganoids 的体外增殖能力最强，但 Trp53^R172H/+和 Trp53^R172H/Δ之间没有显著差异，而且 Pten 状态对 K5 - mUrorganoids 的增殖能力似乎没有影响。在体内致瘤实验中，Trp53^R172H/Δ; Pten^Δ/Δ和 Trp53^Δ/Δ; Pten^Δ/Δ K5 - mUrorganoids 在无胸腺小鼠中的皮下肿瘤发生率相似，但其他基因型则没有形成肿瘤。这再次表明，Trp53 野生型等位基因的丢失和 Pten 的缺失是无胸腺小鼠体内肿瘤形成的必要条件。此外，研究人员还发现，Pten 缺失能促进 Trp53^R172H/+背景下 Trp53 的 LOH，而且 Trp53^R172H/Δ; Pten^Δ/Δ K5 - mUrorganoids 形成的肿瘤在基因表达上具有人类 MIBC 基底 - 鳞状亚型的特征，这说明该小鼠膀胱癌模型能很好地模拟人类疾病。
4. Trp53^R172H/Δ; Pten^Δ/Δ K5 - mUrorganoids 能在免疫健全小鼠中形成肿瘤：随着免疫疗法在膀胱癌治疗中的应用越来越广泛，需要有正常免疫系统的动物模型来研究。研究人员发现，Trp53^R172H/Δ; Pten^Δ/Δ K5 - mUrorganoids 在免疫健全的 B6 小鼠中的肿瘤形成率与在无胸腺小鼠中相当，而 Trp53^Δ/Δ; Pten^Δ/Δ K5 - mUrorganoids 在 B6 小鼠中则不能形成肿瘤。这表明 Trp53^R172H/Δ; Pten^Δ/Δ K5 - mUrorganoids 能很好地模拟人类 MIBC 基底 - 鳞状亚型，是免疫肿瘤学研究的有力工具。进一步研究还发现，通过在无胸腺小鼠中形成肿瘤，Trp53^R172H/Δ; Pten^Δ/Δ和 Trp53^Δ/Δ; Pten^Δ/Δ K5 - mUrorganoids 的肿瘤形成能力都得到了增强，而且 Trp53^Δ/Δ; Pten^Δ/Δ K5 - mUrorganoids 在经过无胸腺小鼠肿瘤形成过程后，在免疫健全小鼠中也获得了肿瘤形成能力。免疫组化分析显示，Trp53^R172H/Δ; Pten^Δ/Δ TuOrs 形成的肿瘤中 CD8 + 淋巴细胞浸润较少，M2 巨噬细胞和调节性 T 细胞（Treg）标记物表达较高，这表明 Trp53R172H 表达和 Trp53 缺失的 K5 - mUrorganoids 之间的肿瘤形成能力差异与免疫肿瘤学机制有关。
5. 突变型 Trp53 表达的类器官与 Trp53 缺失的类器官细胞因子分泌存在差异：研究人员通过细胞因子阵列比较了 Trp53^R172H/Δ; Pten^Δ/Δ和 Trp53^Δ/Δ; Pten^Δ/Δ TuOrs，以及 Trp53^R172H/Δ; Pten^Δ/Δ K5 - mUrorganoids 在不同处理下的细胞因子分泌情况。结果发现，突变型 Trp53 表达的类器官分泌的介导炎症和 CD8 + T 细胞激活的细胞因子比 Trp53 缺失的类器官少，这与人类 MIBC 肿瘤中 TP53 突变伴 LOH 的高发生率以及突变型 Trp53 伴 LOH 的类器官在体内，尤其是在免疫健全小鼠中的高肿瘤形成能力相符。

总的来说，这项研究意义重大。它揭示了 p53 错义突变伴 LOH 以及 Pten 功能缺失在膀胱癌发生中的重要作用机制，从肿瘤内在机制和肿瘤免疫微环境两个方面，解释了为什么在人类癌症中，p53 突变伴 LOH 比纯合缺失更常见。同时，建立的免疫健全小鼠模型具有诸多优势，如可冷冻保存、体内肿瘤形成率高且时间短、肿瘤可在多个部位形成、遗传背景 “干净” 等，为研究膀胱癌的发病机制、肿瘤免疫逃逸机制以及开发新的治疗方法提供了强有力的工具。此外，研究还发现 Pten 缺失与代谢途径的改变有关，这为膀胱癌的治疗提供了新的潜在靶点。相信在这个研究的基础上，未来对膀胱癌的研究和治疗会取得更多突破，为膀胱癌患者带来新的希望。