EZH2 经 DUSP23/SMAD3 通路介导 MMT，或成肾钙化纤维化治疗新靶点

为解决 CaOx 晶体诱导的肾纤维化机制不明及治疗靶点缺乏的问题，武汉大学人民医院的研究人员开展 EZH2 在肾钙化中作用的研究，发现 EZH2 经 DUSP23/SMAD3 通路促进 MMT 和肾纤维化。该研究为肾纤维化治疗提供新靶点，值得一读。

　　

在泌尿系统疾病的领域里，肾结石（urolithiasis）就像一颗 “定时炸弹”，威胁着全球众多人的健康。它的发病率和复发率高得惊人，一般人群的发病率在 1.7% - 14.8% 之间 。而草酸钙（CaOx）结石又是肾结石中最常见的类型，它一旦在肾脏里 “安营扎寨”，就会引发一系列麻烦。CaOx 晶体沉积会诱导肾小管上皮损伤、氧化应激、炎症，还会招来各种免疫细胞在肾脏 “捣乱”。要是肾脏受到的损伤不能完全恢复，就会一步步发展成肾小管功能障碍、肌成纤维细胞激活，最终导致间质纤维化和慢性肾脏病（CKD）。据统计，与正常人相比，肾钙化患者在 18 年内患 CKD 的风险增加了约 60%，在透析患者中，也有 3.2% 的人是因为肾钙化而导致肾衰竭。所以，搞清楚 CaOx 晶体损伤后纤维化的机制，阻止肾钙化向 CKD 发展，就成了医学研究中的当务之急。

近年来，科学家们发现了一个和肾纤维化密切相关的新机制 —— 巨噬细胞向肌成纤维细胞转化（MMT）。在慢性肾脏病中，巨噬细胞会 “摇身一变” 成为肌成纤维细胞，导致胶原蛋白沉积和纤维化。MMT 细胞同时表达肌成纤维细胞标记物（如胶原蛋白 I [Col-I] 或 α - 平滑肌肌动蛋白 [α - SMA]）和巨噬细胞标记物（F4/80 或 CD68） 。在 IgA 肾病、肾移植排斥患者以及实验动物模型中都能找到它们的身影，而且 MMT 细胞的数量还和 CKD 患者的胶原蛋白沉积、肾功能密切相关。但是，在 CaOx 晶体诱导的肾纤维化这个 “战场” 上，MMT 到底扮演着怎样的角色，还是个未解之谜。

与此同时，表观遗传修饰在肾脏损伤和修复过程中的作用也逐渐受到关注。组蛋白甲基化作为表观遗传修饰的主要机制之一，是由组蛋白甲基转移酶（HMTs）给核心组蛋白加上甲基基团。其中，EZH2 作为一种 HMT，能催化组蛋白 H3 赖氨酸 27 的三甲基化（H3K27me3），让目标基因 “沉默”。已有研究表明，在单侧输尿管梗阻（UUO）小鼠模型和 CKD 患者中，EZH2 的表达上调，抑制 EZH2 能减轻肾脏损伤和纤维化 。不过，EZH2 在 CaOx 晶体诱导的肾脏损伤和纤维化中到底起什么作用，还没有完全弄清楚。

为了揭开这些谜团，武汉大学人民医院的研究人员在《Communications Biology》期刊上发表了题为 “EZH2 promotes kidney fibrosis by mediating macrophage-to-myofibroblast transition via the DUSP23/SMAD3 pathway in nephrocalcinosis” 的论文。他们发现，在肾钙化患者和小鼠模型中，巨噬细胞是肌成纤维细胞的重要来源，对 CaOx 诱导的纤维化 “贡献” 很大。EZH2 是促进肾纤维化的关键调节因子，它通过 DUSP23/SMAD3 通路介导 MMT 过程。这一发现为治疗肾钙化相关的肾纤维化提供了潜在的新靶点，就像是在黑暗中找到了一盏明灯，为攻克这一医学难题带来了新希望。

研究人员为了开展这项研究，运用了多种技术方法。在样本检测方面，通过免疫荧光（IF）和流式细胞术来识别 MMT 细胞；采用转录组测序来寻找差异表达基因；利用染色质免疫沉淀（ChIP）来研究 EZH2 与基因启动子区域的结合情况。在动物实验上，构建了多种小鼠模型，如 CaOx 肾钙化小鼠模型、Ezh2 条件性敲除小鼠模型等。在细胞实验中，对巨噬细胞进行分离、培养和处理，还进行了蛋白质免疫印迹、共免疫沉淀、蛋白质 BLAST 和分子对接分析等实验，从多个角度全面地探索相关机制。

下面，我们一起来看看他们的研究结果。

1. 肾钙化相关 CKD 患者和肾钙化小鼠中 MMT 的鉴定：研究人员收集了肾钙化相关 CKD 患者的肾脏标本，把非肿瘤性相邻肾脏组织当作对照组。通过免疫荧光技术，他们发现患者肾脏组织出现了明显的萎缩、肾小管损伤、细胞外基质（ECM）沉积和免疫细胞浸润。在肾间质中，大量巨噬细胞（CD68?）和肌成纤维细胞（α - SMA?）共表达，CD68?α - SMA?的 MMT 细胞占总 α - SMA?肌成纤维细胞的 32.01% 。而且，MMT 细胞的数量和患侧肾小球滤过率相关，MMT 细胞浸润越多，肾小球滤过率越低。在肾钙化小鼠模型中，研究人员通过给小鼠注射乙醛酸（Gly）成功构建了模型，经检测发现肾脏有 CaOx 晶体沉积，肾功能指标 UREA 和 Scr 升高，肾小管损伤、CaOx 晶体、ECM 沉积和羟脯氨酸含量都显著增加。转录组测序显示，20 个 MMT 调节基因中有 15 个在肾钙化小鼠中上调。免疫荧光鉴定出大量 F4/80?α - SMA?的 MMT 细胞，占总 α - SMA?肌成纤维细胞的 34.65% 。这些结果表明，在肾钙化患者和小鼠中，巨噬细胞是肌成纤维细胞的主要来源之一。
2. CLO 介导的巨噬细胞耗竭减轻 CaOx 晶体诱导的肾损伤和纤维化：为了进一步探究巨噬细胞在 CaOx 晶体诱导的肾纤维化中的作用，研究人员利用氯膦酸脂质体（CLO）来耗竭巨噬细胞。CLO 能像 “特洛伊木马” 一样进入巨噬细胞，释放促凋亡的氯膦酸，精准 “打击” 巨噬细胞。实验结果显示，CLO 处理显著减少了肾间质中的 F4/80?巨噬细胞，不仅改善了肾功能，还减轻了肾小管损伤、ECM 沉积、羟脯氨酸含量和 α - SMA 表达。这就说明巨噬细胞在 CaOx 肾钙化的损伤和纤维化过程中起到了推动作用。
3. EZH2 在 CaOx 晶体诱导的肾损伤和纤维化中显著升高：研究人员对肾钙化小鼠和对照组小鼠的差异表达基因（DEGs）进行分析，发现 DEGs 在组蛋白结合、甲基转移酶活性和 SMAD 结合等方面显著富集。在众多组蛋白甲基转移酶基因中，Ezh2 的表达上调最为明显。通过免疫组化、单细胞 ATAC - seq、免疫荧光和免疫印迹等实验证实，在肾钙化患者的肾间质、肾钙化小鼠的 F4/80?巨噬细胞以及 COM 处理的巨噬细胞中，EZH2 的表达都增加了，而且呈剂量依赖性。这表明 EZH2 在 CaOx 晶体诱导的肾损伤和纤维化过程中扮演着重要角色。
4. Ezh2 缺失减少 MMT 细胞并减轻 CaOx 晶体诱导的肾纤维化：研究人员构建了 Ezh2 条件性敲除（Ezh2.iKO）小鼠模型，实验发现，在肾钙化模型建立 12 天后，Ezh2.iKO 小鼠的肾损伤、ECM 沉积、晶体沉积、羟脯氨酸含量、α - SMA 和胶原蛋白 I 的表达以及 MMT 细胞浸润都明显减轻。从巨噬细胞中也能看出，Ezh2.iKO 逆转了 CaOx 晶体导致的促纤维化蛋白表达变化。在体外实验中，用 COM 处理巨噬细胞，模拟体内环境，发现随着 COM 浓度增加，巨噬细胞形态发生改变，EZH2 表达上升。敲低 Ezh2 后，COM 诱导的 MMT 细胞数量明显减少，纤维化标记物表达也恢复正常。这些结果都表明，EZH2 在 CaOx 晶体诱导的 MMT 过程中起着关键作用。
5. EZH2 通过表观遗传修饰抑制 DUSP23 的表达来调节 MMT：研究人员通过 RNA - seq 发现，双特异性蛋白磷酸酶 23（Dusp23）在 Ezh2.iKO 小鼠受到 CaOx 刺激后表达增加明显。免疫荧光显示，肾钙化小鼠 F4/80?巨噬细胞中 DUSP23 表达下调，Ezh2 缺失后则上调。ChIP 实验证实，COM 处理增强了 EZH2 和 H3K27me3 与 Dusp23 基因启动子区域的结合。敲低 Ezh2 后，DUSP23 表达恢复，H3K27me3 水平降低。过表达 Dusp23 能有效减少 COM 诱导的 F4/80?α - SMA? MMT 细胞数量。这一系列实验表明，EZH2 通过表观遗传修饰靶向 DUSP23 来调节 MMT。
6. DUSP23 介导的 SMAD3 在 Ser423/425 位点的去磷酸化减轻 MMT：由于 SMAD3 在 MMT 介导的肾纤维化中起着关键作用，研究人员探究了 DUSP23 与 SMAD3 的相互作用。通过蛋白质 BLAST 和分子对接分析发现，人和小鼠的 DUSP23 和 Smad3 高度保守，DUSP23 和 SMAD3 能形成稳定的蛋白对接模型，SMAD3 的丝氨酸残基 Ser423/425 与 DUSP23 结合得分最高。共免疫沉淀实验证实了它们在巨噬细胞中的相互作用。COM 处理的 RAW264.7 细胞中，SMAD3 在 Ser423/425 位点的磷酸化水平升高，敲低 Ezh2 或过表达 Dusp23 能抑制这一磷酸化过程，同时减少胶原蛋白 I 和 α - SMA 的表达。这说明 DUSP23 通过介导 SMAD3 在 Ser423/425 位点的去磷酸化来减轻 MMT。
7. GSK - 126 对 EZH2 的药理抑制改善肾钙化中 MMT 介导的肾纤维化：研究人员评估了 EZH2 的高度选择性抑制剂 GSK - 126 的作用。在肾钙化小鼠中，GSK - 126 降低了 Scr、UREA 水平和 F4/80?α - SMA? MMT 细胞数量，减轻了肾损伤、ECM 沉积、CaOx 沉积和羟脯氨酸含量，还减少了 EZH2 和促纤维化蛋白的表达。在体外实验中，GSK - 126 阻止了巨噬细胞的形态改变和 MMT 过程，调节了相关蛋白的表达。这表明 EZH2 可以作为治疗肾钙化中 MMT 介导的肾纤维化的潜在靶点。

综合这项研究的结论和讨论部分来看，研究人员发现巨噬细胞是肾钙化中肌成纤维细胞的重要来源，参与了 CaOx 诱导的纤维化过程。EZH2 是促进肾纤维化的关键调节因子，它通过抑制 Dusp23 的表达，导致 SMAD3 在 Ser423/425 位点磷酸化，从而促进 MMT 过程，加重肾纤维化。而抑制 EZH2，无论是通过基因敲除还是药物抑制，都能减轻 MMT 和肾纤维化。这一研究成果意义重大，为肾钙化相关肾纤维化的治疗提供了新的理论依据和潜在治疗靶点。未来，如果能针对 EZH2 开发出有效的治疗方法，或许就能为肾钙化患者带来新的希望，阻止他们的病情向慢性肾脏病发展，改善他们的健康状况。同时，也为相关领域的研究指明了新的方向，激励更多科研人员深入探索肾纤维化的发病机制和治疗策略。