解锁 GBP2 的神秘 “变身” 密码：核苷酸如何重塑免疫 “卫士” 的微观世界？

为解决 GBP2 激活和调节机制不明等问题，研究人员开展 GBP2 核苷酸诱导构象变化的研究。结果发现 GBP2 在 GTP 水解时的二聚化及构象变化规律。这为揭示 GBP2 免疫作用机制提供依据，强烈推荐科研读者阅读。

　　

在细胞的微观世界里，有一种神秘的 “守护者”，它就是鸟苷酸结合蛋白（GBPs）。GBPs 是一类由干扰素诱导产生的 GTP 酶，在人体抵御各种病原体入侵的过程中发挥着至关重要的作用。就像一群训练有素的 “细胞卫士”，一旦干扰素发出 “警报”，GBPs 便迅速行动起来，投入到对抗病原体的战斗中。

GBPs 家族十分庞大，在真核生物中广泛存在。人类的 GBP 家族有 7 名成员，分别是 GBP1 - 7，它们都位于 1 号染色体上。这些 “卫士” 各有所长，它们由 N 端的 G 结构域和 C 端的螺旋区域组成，部分 GBPs 的 C 端经过修饰后能够定位到细胞膜结构上，从而更好地履行防御职责。而且，GBPs 与在膜重塑过程中起关键作用的发动蛋白家族关系密切，它们可以通过 G 结构域形成同源二聚体，就像两个卫士携手合作，共同应对病原体的威胁。

GBPs 在免疫防御中的作用多种多样。它们可以抵御细菌、寄生虫和病毒等病原体的入侵。比如，GBP1 能识别病原体的特定结构，像革兰氏阴性菌的脂多糖（LPS），并通过一系列复杂的机制，破坏细菌的结构，引发细胞焦亡（一种程序性细胞死亡方式），从而消灭病原体。GBP2 也能识别 LPS，还能促进 caspase - 4 的激活，在免疫防御中发挥着重要作用。

然而，尽管 GBPs 如此重要，科学家们对它们的了解还远远不够。GBP2 作为 GBPs 家族中两个诱导性最强的成员之一，却没有像 GBP1 那样被深入研究。目前，关于 GBP2 的激活和调节机制，尤其是核苷酸结合如何引起 GBP2 构象变化，仍然是个谜。GBP2 与 GBP1 虽然在序列上有较高的相似性，但它们在功能上却存在差异。例如，GBP1 能够快速将 GTP 水解为 GMP，而 GBP2 产生 GMP 的效率则低得多，超过 75% 的水解产物是 GDP。而且，GBP2 与不同核苷酸的结合特性也与 GBP1 不同，GDP 对 GBP2 的 GTP 水解有很强的抑制作用，却不影响 GBP1。此外，GBP2 在 GTP 水解过程中如何与二聚化相互作用，以及 GDP 形成和释放后会发生什么，这些问题都亟待解决。

为了揭开这些谜团，研究人员在《Communications Biology》期刊上发表了题为 “Structural insights into nucleotide - induced conformational changes in guanylate - binding protein 2” 的论文。他们通过深入研究，得出了一系列重要结论，为我们理解 GBP2 的工作机制提供了关键线索，这对于进一步探索免疫系统的奥秘具有重要意义。

在这项研究中，研究人员运用了多种先进的技术方法。他们利用晶体学分析技术，解析 GBP2 在结合不同核苷酸时的晶体结构，从而直观地观察其分子构象的变化；通过蛋白质表达和纯化技术，获取足够量且高纯度的 GBP2 及相关突变体蛋白，为后续实验提供材料；借助分析型尺寸排阻色谱和多角度光散射技术，研究 GBP2 在溶液中的寡聚状态变化；采用比色法孔雀石绿检测、荧光标记核苷酸结合实验等方法，测定 GBP2 的 GTP 酶活性和核苷酸结合能力 。

下面让我们一起来看看研究人员都有哪些重要发现吧。

GBP2 在溶液中水解 GTP 时形成二聚体

研究人员首先在大肠杆菌中表达并纯化了全长人类 GBP2（1 - 591）和 GBP2 的 G 结构域（GBP2GD，1 - 309）。通过尺寸排阻色谱分析发现，没有结合核苷酸的全长 GBP2 以单体形式存在，而没有结合核苷酸的 GBP2GD 大部分也是单体，但有一部分会以二聚体形式出现。当研究人员让 GBP2 与不同的鸟嘌呤核苷酸结合时，有趣的现象发生了：与不可水解的 GTP 类似物 GMPPNP 或 GDP 结合时，GBP2 保持单体状态；然而，当与模拟 GTP 水解过渡态的 GDP?AlFx 结合时，全长 GBP2 会完全转变为二聚体，这一结果通过多角度光散射技术得到了进一步证实。而且，GBP2 的二聚化依赖于其核苷酸结合能力和 GTP 酶活性，当关键活性位点发生突变（K51A）时，即使与 GDP?AlFx 结合，GBP2 也会保持单体状态。相比之下，GBP2GD 的二聚化模式有所不同，与 GMPPNP 结合时会诱导其形成完全的二聚体，即使在过量的 GDP?AlFx 存在下，仍有超过一半的 GBP2GD 保持单体状态。这表明在全长 GBP2 中，C 端螺旋结构域可能提供了额外的二聚化界面，或者通过别构效应稳定了 GTP 水解过渡态时 GBP2 的二聚体。

GBP2GD 与 GDP 结合的晶体结构揭示了封闭的活性位点

为了深入了解 GBP2 的活性和二聚化的分子机制，研究人员测定了 GBP2GD 与 GDP 结合的 2.1 ? 晶体结构，这一结构代表了 GBP2 水解后的产物结合状态。GBP2GD 的整体结构包含七个 β 折叠和七个 α 螺旋，属于小 GTP 酶的典型结构，并带有 GBP 家族特有的插入序列。在这个结构中，GDP 的鸟嘌呤碱基和核糖被 G1 基序、G4/RD 基序和鸟嘌呤帽（aa 236 - 255）包围，G4/RD 基序通过氢键与鸟嘌呤部分相互作用，而 GDP 的二磷酸基团则紧密地嵌入由 G1/P 环、G2/Switch I 和 G3/Switch II 基序形成的口袋中。研究人员还发现，GBP2GD?GDP 结构与同源的 GBP1 与 GMPPNP 结合的结构有显著的构象差异，尤其是在 G2/Switch I 区域和 GD 另一侧的远端区域。而且，GBP2GD?GDP 的活性位点更为封闭，与 GBP1 快速水解 GTP 生成 GMP 不同，GBP2 主要的水解产物是 GDP。通过比较 GBP2GD?GDP 和 GBP1GD?GMP 的结构，研究人员发现虽然部分残基的取向相似，但 G2 基序和鸟嘌呤帽的位置有很大变化。此外，GBP2GD 在结合 GDP 时是单体，结合 GDP?AlFx 时部分为二聚体，通过结构叠加分析，研究人员确定了 GBP2GD?GDP 单体状态的结构特征，即 Switch I 和 Switch II 区域的构象重排使得 GTP 水解为 GDP 后，大部分 GBP2 无法形成二聚体。

G 基序残基的突变消除了 GBP2 的 GTP 酶活性

在 GBP2GD?GDP 晶体结构中，研究人员注意到几个保守的 G1 和 G3 残基与二磷酸基团相互作用，包括 R48、K51 和 E99。为了验证这些观察结果，他们对 GBP2FL 和 GBP2GD 中的这些残基进行了突变，并使用比色法孔雀石绿检测突变体与野生型蛋白的活性。结果发现，G1 基序中 R48 或 K51 突变为丙氨酸（R48A 和 K51A）完全消除了 GBP2FL 和 GBP2GD 的 GTP 酶活性，而对远离 GDP 的 G2 残基 S73 进行突变（S73A）则不影响其活性。研究人员对 G3 基序中的 E99 特别感兴趣，因为它的负电荷在晶体结构中紧邻 β - 磷酸。将 E99 突变为谷氨酰胺（E99Q）使 GTP 酶活性降低至野生型的约 40%，而突变为亮氨酸或天冬氨酸（E99L 和 E99D）则完全消除了 GBP2 的活性，这表明 E99 的负电荷在活性位点的精确位置对 GTP 酶活性至关重要。进一步研究发现，E99L 突变使 GBP2GD 对 GTP 和 GDP 的结合亲和力降低了 4 - 5 倍，而且在没有 Mg2?的情况下，E99L 突变体对 GTP 和 GDP 仍保持一定的亲和力，甚至比野生型更强，这说明 E99 在正确定位 Mg2?以实现鸟嘌呤核苷酸的高亲和力结合中起着重要作用。此外，E99L 突变体在存在 GMPPNP 或过渡态模拟物 GDP?AlFx 时不会发生二聚化，表明其催化功能存在缺陷。同时，研究人员还发现 GBP2GD 的活性略高于 GBP2FL，而添加 GBP2 的 C 端螺旋结构域（CHD）不会影响 GBP2GD 的活性，说明孤立的 GBP2CHD 不会通过反式作用影响 GBP2GD 的 GTP 酶活性。

无核苷酸全长 GBP2 K51A 突变体的晶体结构揭示了 CHD 的结构可塑性

GBP2FL 和 GBP2GD 在核苷酸结合时的二聚化模式不同，但 GTP 水解活性相似。为了探究这种差异的结构基础，研究人员对 GBP2FL 进行了结构表征。由于全长 GBP2 的表达量低，研究人员通过将活性位点赖氨酸突变为丙氨酸（K51A），成功提高了产量并获得了其晶体结构。该结构呈现出伸长的形状，GTP 酶结构域位于一端，C 端螺旋结构域延伸约 90 ?。C 端螺旋结构域由七个 α 螺旋组成，与 G 结构域存在静电相互作用。与无核苷酸的 GBP1 结构相比，GBP2^K51A的 C 端螺旋区域远端移动了 18 ?，显示出显著的摆动运动。而且，GBP2^K51A的核苷酸结合口袋比 GBP2GD?GDP 结构中的更开放，这可能与 C 端螺旋结构域的运动有关。

综合这些研究结果，研究人员提出了 GBP2 在 GTP 水解循环中的工作模型。在这个模型中，GBP2 在 GTP 水解过程中会发生大规模的构象变化。GTP 结合和水解会诱导 G 结构域（GD）的构象变化，包括核苷酸结合区域以及核苷酸结合区域另一侧的 α3、α3’和 α4 区域。K51 - E99 相互作用与 Switch I 环的重新定位密切相关，这种相互作用的破坏会影响 GTP 结合和水解所需的镁离子的配位。GD 的构象变化促使其形成二聚体，这些变化还会通过 α3 - α3’连接子传递到 CHD，导致 α12 远离 GD，从而有利于在过渡态形成交叉结构。然而，目前还没有全长二聚体 GBP 的结构来证实这种封闭的二聚体构象。研究人员推测，在溶液中，二聚体 GBP2 的 α12 和 α13 可能存在多种构象，从与另一个原聚体的 GD 紧密相互作用到完全伸展。一旦结合的 GTP 水解，无机磷酸释放，GBP2 会转变为 GDP 结合的构象，导致 GD 介导的二聚体解离，最后 GDP 释放，GBP2 回到无核苷酸状态，完成一个 GTP 水解循环，为下一轮的 GTP 结合和水解做好准备。

这项研究对于我们理解 GBP2 在免疫反应中的作用机制具有重要意义。它为进一步探究 GBP2 在免疫系统中的精确分子机制奠定了基础，有助于我们深入了解细胞自主免疫的过程。同时，这些发现也为开发新的策略来对抗病原体入侵提供了潜在的靶点。未来，研究人员可以基于这些结果，进一步研究 GBP2 与病原体之间的相互作用，以及如何通过调节 GBP2 的活性来增强机体的免疫防御能力，为人类健康事业的发展提供更多的可能。