揭秘犏牛雄性不育之谜：睾丸支持细胞转录组差异藏玄机

为解决雄性犏牛不育及牦牛杂交育种受阻问题，研究人员开展牦牛和犏牛睾丸支持细胞转录组差异研究。结果发现犏牛支持细胞基因表达异常，Claudin - 11 或关键。推荐阅读，助您了解犏牛不育分子机制及育种难题突破点。

　　

在青藏高原，牦牛可是当之无愧的 “明星家畜”，它就像高原上的 “船”，带着人们在这片广袤的土地上生活、劳作。牦牛拥有超强的适应能力，能在青藏高原的极端环境中生存繁衍，不过它的生产性能却比普通牛差了不少。聪明的人们通过长期的实践发现，让普通牛（当爸爸）和牦牛（当妈妈）进行跨物种杂交，它们的后代 —— 犏牛，在生产性能、役用能力、产奶和产肉方面都有着明显的优势，而且犏牛和牦牛一样，对青藏高原的恶劣环境适应良好。

可在杂交育种的过程中，人们遇到了一个大难题：第一代雄性犏牛不育。这就好比一颗美味的果实，看着诱人却没办法收获它的种子，继续培育出更多同样优秀的后代。因为雄性犏牛不育，它们优秀的基因组合没办法通过杂交传递下去，大大阻碍了牦牛杂交育种的进程。

为了攻克这个难题，科研人员们从宏观到微观，从组织形态到分子生物学，全方位地研究雄性犏牛不育的现象。在组织形态方面，研究发现犏牛的睾丸和附睾重量、大小都比不上牦牛，而且犏牛的阴囊又小又窄，血管少，弹性差，质地还软。从细胞层面来看，第一代雄性犏牛睾丸生殖细胞的凋亡率很高，它的生精小管里只有精原细胞和少量精母细胞，缺乏高度分化的生殖细胞。在分子层面，也有不少发现，比如犏牛睾丸中 Dazl 基因不表达，F1 初级精母细胞中 cg14 基因不表达，Boule、SYCP3 等一些和精子发生相关的基因在犏牛体内表达水平很低。另外，组蛋白甲基化在犏牛精子发生失败和雄性不育中也起着重要作用。

在众多研究中，有一种细胞引起了科研人员的特别关注，那就是支持细胞（Sertoli cells）。支持细胞附着在生精小管的基底膜上，和生殖细胞紧密相连，它可是精子发生微环境的重要组成部分，在整个精子发生周期里都发挥着关键作用。支持细胞不仅能给生殖细胞提供物理支撑，维持精子发生的稳定微环境，还能分泌各种蛋白质，调节生殖细胞的增殖、分化、凋亡、吞噬和免疫赦免。之前就有研究发现，牦牛和犏牛的生殖细胞、睾丸支持细胞在组蛋白修饰和甲基转移酶表达上有明显差异，而且犏牛睾丸中与支持细胞发育和类固醇生成相关的基因表达水平较低。还有研究表明，牦牛支持细胞在低氧条件下能量代谢、紧密连接和免疫调节的变化可能对精子发生有利，而犏牛和牦牛支持细胞的分布存在差异，犏牛睾丸的体细胞微环境可能不利于精子发生。种种迹象都表明，犏牛支持细胞可能存在缺陷，所以对牦牛和犏牛支持细胞进行全转录组分析，说不定就能找到解决犏牛不育问题的关键。

为了深入探究这个问题，四川农业大学等单位的研究人员在《BMC Veterinary Research》期刊上发表了一篇名为《Transcriptome analysis reveals abnormal gene expression in Sertoli cells of cattle-yak testes》的论文。他们通过研究发现，和牦牛支持细胞相比，犏牛支持细胞中与蛋白质激活、细胞功能和膜细胞器组成相关的基因表达出现了异常。这一发现就像是在黑暗中找到了一丝曙光，为进一步研究雄性犏牛不育的原因提供了重要线索。而且，研究还指出 Claudin - 11 基因可能是后续研究雄性犏牛不育的关键基因，这无疑为科研人员们指明了一个重要的研究方向。

这项研究意义重大，它不仅有助于我们更深入地了解雄性犏牛不育的分子机制，为解决牦牛杂交育种难题提供理论依据，还能为后续研究提供重要的参考，说不定未来就能找到让雄性犏牛恢复生育能力的方法，推动牦牛产业的发展。

那么，研究人员是怎么开展这项研究的呢？他们主要运用了以下几种关键技术方法：首先是细胞分离与培养技术，从 24 月龄的 3 头健康雄性犏牛和 3 头 F1 代雄性牦牛身上采集睾丸组织，经过酶消化、差异贴壁和饥饿处理，分离出支持细胞；接着用免疫荧光染色技术，通过 DATA - 4 和 SOX9 免疫荧光染色来鉴定细胞类型；然后运用转录组测序技术，对支持细胞进行测序分析；最后采用 RT - qPCR 和 Western blotting 技术，对差异表达基因进行验证。

下面我们来详细看看研究结果。

支持细胞的分离与培养

研究人员把牦牛和犏牛的睾丸组织用混合酶消化，经过过滤、离心得到混合细胞。培养 24 小时后发现，牦牛睾丸组织消化得到的混合细胞数量，包括贴壁细胞和悬浮细胞，都比犏牛的多。把混合细胞进行差异贴壁处理，收集贴壁细胞，再用血清饥饿处理 48 小时，然后加入完全培养基继续培养 3 天。这时可以看到，贴壁细胞轮廓清晰，呈现多边形或长纺锤形，而且牦牛贴壁细胞的数量比犏牛多很多，但两种细胞的形态相似。这就像是在实验室里成功 “养大” 了两种细胞，为后续研究打下了基础。

支持细胞的鉴定

研究人员把贴壁细胞用胰酶消化传代，选取第三代细胞进行鉴定。通过油红 O 染色和 GATA - 4、SOX9 免疫荧光染色发现，牦牛和犏牛的贴壁细胞在油红 O 染色下都能看到粉红色和橙色的脂滴。免疫荧光染色显示，支持细胞的标记蛋白 GATA - 4 和 SOX9 在两种牛的支持细胞中都清晰表达，这表明分离得到的细胞大部分都是支持细胞，纯度超过了 90%，说明研究人员成功分离出了高纯度的支持细胞。

转录组测序与基因表达差异分析

研究人员对牦牛和犏牛的支持细胞进行转录组测序，然后进行主成分分析和 Pearson 相关性分析。主成分分析发现，牦牛支持细胞和犏牛支持细胞在转录组上存在差异，能够区分它们的 mRNA 表达水平；Pearson 相关性分析表明，样本之间有差异，而且组内具有可重复性，证明了转录组数据是可靠的。这就好比给细胞的基因信息拍了一张清晰的照片，让研究人员能清楚地看到它们之间的不同。

差异基因分析

通过 Venn 图分析，发现牦牛和犏牛支持细胞有各自特异性表达的基因，也有共同表达的基因。以牦牛支持细胞为对照，研究人员筛选出了 6592 个差异表达基因，其中犏牛支持细胞中 3007 个基因上调，3585 个基因下调。聚类分析热图显示，牦牛和犏牛支持细胞的基因表达趋势不同，组内基因表达一致，说明筛选出的差异 mRNA 具有明显的差异特征，这些差异基因可能就是导致犏牛不育的 “小秘密”。

差异表达基因的 GO 分析

研究人员对 5969 个差异表达基因进行 GO 分析，发现犏牛支持细胞中上调的基因主要参与翻译、肽生物合成过程、酰胺生物合成过程等，这说明犏牛支持细胞的蛋白质合成功能很旺盛；而下调的基因主要参与蛋白质磷酸化、磷酸化过程等，这意味着犏牛支持细胞在蛋白质激活过程方面可能存在不足，而且与蛋白质激酶活性和膜细胞器组成相关的基因表达下调，表明犏牛支持细胞在蛋白质功能上可能有缺陷。这就像是发现了犏牛支持细胞在工作时的一些 “短板”。

差异表达基因的 KEGG 分析

对 2580 个差异表达基因进行 KEGG 分析，发现有 837 个差异表达基因匹配到 316 条 KEGG 通路，其中 8 条通路显著富集。犏牛支持细胞中上调的基因在核糖体、产热和氧化磷酸化等通路显著富集，说明犏牛支持细胞的大分子合成能力不弱；而下调的基因在黏着连接、mTOR 信号通路、AMPK 信号通路等通路显著富集，这表明犏牛支持细胞在细胞增殖、细胞周期、凋亡、细胞黏附和细胞间相互作用等一系列细胞功能上存在缺陷。

转录组测序数据的 RT - qPCR 验证

研究人员选取了一些与血睾屏障形成、睾丸发育、细胞生理功能和精子发育相关的基因，如 ISOC2、RPL27A、FISI 等进行 RT - qPCR 验证。结果显示，这些差异表达基因的表达情况与 RNA - seq 测序结果一致，说明 RNA - seq 测序数据是可靠的。这就像是给之前的研究结果上了一道 “保险”，让研究结论更有说服力。

牦牛和犏牛支持细胞 Claudin11 表达的检测

研究发现，牦牛支持细胞中 Claudin11 的 mRNA 和蛋白质表达水平都比犏牛高。Claudin11 与支持细胞的分化和旁分泌相互作用密切相关，它的表达差异可能对精子发生有重要影响，所以它可能是进一步研究雄性犏牛不育的重要分子。

综合研究结果和讨论部分，我们可以得出这样的结论：研究人员成功分离并鉴定了牦牛和犏牛的支持细胞，通过转录组分析发现犏牛支持细胞中许多与蛋白质激活、细胞功能和膜细胞器组成相关的基因表达异常。这些异常可能会影响支持细胞为精子发生创造合适的环境，从而导致雄性犏牛不育。Claudin - 11 基因在牦牛和犏牛支持细胞中的表达差异显著，很可能是研究雄性犏牛不育的关键基因。

这项研究为我们深入了解雄性犏牛不育的机制提供了重要依据，就像为我们打开了一扇通往神秘基因世界的大门，让我们看到了犏牛不育背后的 “基因密码”。不过，研究也存在一些局限性，比如样本量较小，对 Claudin - 11 等差异表达基因的功能验证还不够深入。但这并不影响它的重要性，它为后续研究指明了方向，相信在未来，科研人员们会沿着这个方向继续探索，最终攻克雄性犏牛不育这个难题，让牦牛杂交育种取得更大的突破，为高原地区的畜牧业发展带来新的希望。