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为解决生牛奶中大肠杆菌引发的抗菌药物耐药性（AMR）对公众健康的威胁问题，印度古吉拉特邦研究人员开展相关研究。他们发现多种耐药基因及突变等，这为防控致病性大肠杆菌传播提供依据，推荐科研读者一读。
在全球范围内，抗菌药物耐药性（AMR）正如同一场 “无声的大流行”，肆意蔓延，跨越了地理界限和人畜之间的屏障。这可不是一个小问题，它已经成为了全球健康领域的重大危机。据预测，如果不采取多部门联合行动，到 2050 年，AMR 可能会导致 1000 万人死亡，造成高达 100 万亿美元的经济损失。
印度作为一个人口众多的国家，也深受 AMR 的困扰。2017 年，印度政府专门制定了《国家抗菌药物耐药性行动计划（NAP - AMR）》，就是为了努力控制这一严峻的局面。而在印度的古吉拉特邦，当地政府在 2022 年也宣布了 “关于 AMR、超级细菌和一体化健康的网络计划”。
牛奶，本是人们生活中常见的营养饮品，富含蛋白质，深受大家喜爱。在古吉拉特邦，生牛奶更是一种价格亲民、随处可得的蛋白质来源，无论是城市还是乡村，都有大量的生产和消费。然而，牛奶却也是细菌滋生的温床，尤其是一些致病细菌，更是喜欢在牛奶中 “安营扎寨”。大肠杆菌（Escherichia coli，简称E. coli）就是其中的 “捣乱分子” 之一，它通常存在于人和动物的肠道中，但一旦通过受污染的牛奶和乳制品传播，就可能摇身一变成为致病菌，给人类健康带来威胁。不仅如此，大肠杆菌还存在于肉类和奶牛粪便中，时刻 “潜伏” 着，等待机会感染人类。
近年来，随着细菌耐药性问题日益严重，各种耐药机制也逐渐被科学家们发现。像质粒、转座子、整合子和噬菌体等，都在耐药基因的传播过程中发挥了重要作用。尤其是超广谱 β - 内酰胺酶（ESBL）基因的出现，让抗生素耐药性问题愈发严重，令人担忧。而且，细菌的基因突变不断积累，也使得它们对临床常用抗生素的耐药性越来越强。各种毒力基因更是在细菌的致病性和疾病表现中扮演着关键角色，让细菌变得更加 “狡猾” 和危险。
为了深入了解这些问题，古吉拉特邦相关研究人员在《Scientific Reports》期刊上发表了一篇名为 “In - vitro and in - silico analysis of antimicrobial resistance, mutations, virulence factors, mobile genetic elements, and diversity of Escherichia coli in cattle raw milk” 的论文。这项研究意义重大，它通过对生牛奶中大肠杆菌的研究，揭示了其耐药性、基因突变、毒力因子、可移动遗传元件和多样性等方面的情况，为制定有效的监测、缓解和教育策略，防止致病性大肠杆菌通过食物链传播提供了关键依据。
研究人员在开展这项研究时，用到了几个关键技术方法。首先是细菌的分离与鉴定技术，从 50 份生牛奶样本中分离出细菌，并通过革兰氏染色和生化鉴定试剂盒确定其中大肠杆菌的存在。接着，采用 Kirby - Bauer 纸片扩散法进行抗生素敏感性测试，判断大肠杆菌对多种抗生素的耐药情况。然后，运用全基因组测序技术，对 10 株耐多药的大肠杆菌进行深入的基因分析。最后，借助生物信息学分析工具，对测序数据进行处理，从而确定抗生素耐药基因、毒力基因、可移动遗传元件等信息。
下面来看看具体的研究结果：
- 生牛奶中大肠杆菌的流行情况：研究人员在古吉拉特邦采集的 50 份生牛奶样本中，共分离出 56 株细菌，其中 26 株被鉴定为大肠杆菌。这些大肠杆菌在 MacConkey 琼脂平板上会形成明亮的粉红色菌落，在伊红美蓝琼脂平板上则会呈现出金属绿色光泽。在显微镜下观察，它们是革兰氏阴性、中等大小且具有运动性的杆菌。经过生化检测，它们的过氧化氢酶、甲基红和吲哚试验呈阳性，而 Voges - Proskauer 试验呈阴性。
- 大肠杆菌的抗生素敏感性测试：通过抗生素敏感性测试发现，大肠杆菌对 β - 内酰胺类抗生素的耐药率极高。其中，96.15%（n = 25）的菌株对氨苄西林耐药，92.30%（n = 24）的菌株对头孢吡肟耐药。对其他多种抗生素，如阿莫西林克拉维酸（88.46%，n = 23）、亚胺培南（69.23%，n = 18）等，也有较高的耐药率。在 26 株分离株中，10 株被确定为泛耐药（XDR），9 株为耐多药（MDR），7 株为敏感菌株。
- 16S rRNA 基因的 PCR 扩增：为了进一步确认 10 株 XDR 分离株是否为大肠杆菌，研究人员通过 PCR 扩增 16S rRNA 基因。他们从大肠杆菌分离株中提取纯化的 DNA，用于 PCR 检测。结果验证了 16S rRNA 基因的存在，证实这 10 株分离株确实是大肠杆菌。之后，这些确认的大肠杆菌分离株被送去进行全基因组测序，以便更深入地了解它们的基因特征。
- 全基因组测序和生物信息学数据分析：研究人员对 10 株 XDR 大肠杆菌进行了全基因组测序，并将测序数据提交到 NCBI（生物项目编号：PRJNA1109570）。通过分析发现，这些大肠杆菌携带了多种抗生素耐药基因（ARGs），如 β - 内酰胺酶基因（bla<sub>EC</sub>、bla<sub>CTX - M - 15</sub>、bla<sub>TEM - 1B</sub>等）、外排耐药基因（emrD、mdtM等）、喹诺酮耐药基因（qnrS1）等。同时，还检测到了许多基因突变，这些突变发生在marA、marR、acrR等多个基因上，可能导致多种耐药模式。
- 大肠杆菌的毒力因子（VFs）：所有测序的大肠杆菌分离株都含有多种与毒力相关的基因。其中，最保守的毒力因子包括yehA、yehB、yehC、yehD（YHD 菌毛簇，与黏附作用有关）、cia（与黏菌素相关）、cvaC（微菌素 C）等。这些毒力因子在细菌克服宿主防御系统、引发疾病的过程中发挥着重要作用。
- 大肠杆菌的可移动遗传元件：
- 质粒：大部分大肠杆菌分离株携带的质粒属于不相容 F（IncF）组，如 IncFIB (PB171)、IncFIB (AP001918) 等。在一些菌株中，还检测到了质粒介导的耐药基因，比如bla<sub>TEM - 1</sub>、sul2、dfrA14等，这些基因分别赋予细菌对 β - 内酰胺类、叶酸途径拮抗剂等多种抗生素的耐药性。
- 插入序列（IS）和转座子：研究人员在分离株中检测到了 26 种不同类型的插入序列和转座子。例如，在 AMR4 菌株中检测到了 Tn2 单位转座子，在 AMR7 菌株中检测到了 Tn10 转座子，它们与四环素耐药基因（tet(B)）相关，能够编码抗生素耐药性，促进耐药基因在细菌间的传播。
- 比较基因组分析：通过与参考菌株进行比较基因组分析，研究人员发现 AMR1、AMR3、AMR5 和 AMR6 这几株菌与参考菌株完全匹配，这表明它们携带了bla<sub>CTX - M - 15</sub>基因。这种分析有助于了解不同菌株之间的基因差异和相似性，为研究细菌的进化和传播提供了重要线索。
- 大肠杆菌的噬菌体分析：噬菌体在细菌耐药基因的传播中也有重要作用。研究发现，10 株测序的大肠杆菌中有 9 株至少携带 1 种噬菌体，噬菌体的大小在 19.9 kb 到 46.5 kb 之间。虽然在噬菌体中没有检测到 ARGs，但它们含有的开放阅读框（ORFs）可能允许其他可移动遗传元件整合到噬菌体基因组中，从而间接影响细菌的耐药性。
- 大肠杆菌的基因组多样性：研究人员对大肠杆菌进行了系统发育分组、多位点序列分型（MLST）和血清型分析。结果发现，大肠杆菌分离株属于 A 和 B1 两个系统发育组。MLST 分析显示，10 株测序分离株中有 9 株具有不同的序列类型（STs），还鉴定出了 4 种新的 STs。同时，还确定了多种血清型，包括 O9:H30、O90:H5 等，其中 AMR6 菌株还发现了一种新的血清型。
综合研究结果和讨论部分来看，这项研究意义非凡。它首次对古吉拉特邦生牛奶中的大肠杆菌进行了 AMR 监测，发现该地区大肠杆菌的流行率达到了 46%。研究中发现的高耐药率，尤其是对 β - 内酰胺类抗生素的耐药，表明细菌的耐药性在不断进化，可能是由于水平基因转移等因素导致的。同时，研究还揭示了大肠杆菌中存在多种耐药基因、毒力因子和可移动遗传元件，这些都增加了细菌的致病性和传播风险。而且，研究中鉴定出的新序列类型和血清型，也为进一步了解大肠杆菌的多样性提供了新的信息。
总之，这项研究强调了基因组监测对于理解 AMR 分子动态的重要性。通过深入研究，我们能够制定出更有针对性的策略，来管理和减轻 AMR 病原体的传播。面对生牛奶中可能存在的危险耐药细菌，如大肠杆菌等，采取多方面的协同行动至关重要。只有这样，才能有效保障公众健康，防止耐药细菌通过食物链对人类造成更大的威胁。
