非破坏性基质周转：致病菌生物膜聚集体生长的保守特征 —— 揭示细菌 “堡垒” 构建的关键机制

本文聚焦细菌生物膜（biofilm），研究发现铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和霍乱弧菌（Vibrio cholerae）等致病菌生物膜基质存在非破坏性周转现象。新合成的胞外多糖（EPS）在聚集体外周沉积，基质蛋白 CdrA 经酶解后仍具功能，这一发现有助于深入理解生物膜形成机制，为抗生物膜策略提供新思路。

　　### 研究背景
细菌形成的多细胞聚集体 —— 生物膜（biofilm），其胞外基质由胞外多糖（EPS）、蛋白质和胞外 DNA 等组成。生物膜可引发难以治疗的感染，因其能抵御抗生素、宿主免疫系统和机械清除。铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是研究生物膜的模式生物，其生物膜基质成分包括 Psl、Pel、CdrA 和 eDNA 等，且 EPS 在生物膜聚集体外周富集。此外，生物膜聚集体在生命周期中会发生变化，如扩张或失去生物量，这与基质的动态变化相关。同时，不同细菌物种的生物膜基质构建块有相似性，因此探究生物膜基质组装和动态变化的机制具有重要意义。

实验方法

1. 细菌菌株、培养基和生长条件：实验使用多种细菌菌株，包括铜绿假单胞菌 PAO1 菌株、大肠杆菌（Escherichia coli）和霍乱弧菌（Vibrio cholerae）等。培养时，浮游培养物常规在 LB 培养基中 37°C、225rpm 振荡培养；构建突变体的菌株在 LB 肉汤中 37°C 培养，培养过程中使用相应抗生素进行筛选和维持质粒。霍乱弧菌在 LB 培养基中过夜培养后，在 M9 培养基中进行生物膜生长实验。
2. 流动细胞生物膜和共聚焦显微镜观察：将细菌菌株在 LB 培养基中培养至对数中期，稀释后接种到流动细胞培养室，在室温下连续供应新鲜 1% LB 培养基进行生物膜培养。使用共聚焦显微镜观察生物膜，对 Psl 染色使用 HHA 荧光标记物，对霍乱弧菌生物膜使用 WGA 荧光标记物，通过不同时间点的染色和成像，分析生物膜的结构和成分分布。
3. 试管生物膜实验：在硅胶管中接种细菌悬液，室温下以 10mL/h 的流速在 1% LB 培养基中培养 5 天。实验结束后，收集流出液，处理试管内的生物膜样本，分离生物膜基质和细菌细胞，用于后续分析。
4. 蛋白质免疫印迹分析（Western blot analysis）：使用特定的凝胶和转移膜对 CdrA 和 LasB 等蛋白质进行电泳和转移，然后用相应的抗体进行检测，分析蛋白质在不同样本中的表达和降解情况。
5. LasB 活性测定：通过在生物膜基质样本中加入荧光底物，测量荧光强度随时间的变化，从而确定 LasB 在生物膜基质中的活性。
6. Edman 降解法：用于确定 CdrA 被 LasB 酶解后的 N 端序列，以明确酶切位点。
7. 聚集实验和其他实验：进行聚集实验评估细菌的聚集能力，通过结晶紫实验评估静态生物膜形成能力，通过附着实验分析细菌的附着情况。

实验结果

1. 新 Psl 在聚集体外周沉积并促进聚集体扩张：通过脉冲追踪标记实验，用不同荧光标记的 Psl 特异性凝集素对 PAO1 GFP⁺流动细胞生物膜进行标记。结果显示，新产生的 Psl 在生物膜聚集体外周沉积，且原有 Psl 的位置不会随聚集体生长向外迁移。条件表达 Psl 的实验表明，持续的 Psl 产生对聚集体生长是必要的，但对生物膜的维持并非必需。
2. 霍乱弧菌也在生长的生物膜聚集体外周沉积 EPS：用不同荧光标记的 VPS 结合凝集素培养霍乱弧菌生物膜，结果显示新添加的凝集素在生物膜聚集体外周染色，与铜绿假单胞菌的 EPS 沉积模式相似，表明 EPS 在生物膜聚集体外周沉积可能是生物膜形成的保守原则。
3. 细胞游离形式的 CdrA 保留在生物膜基质中：通过蛋白质免疫印迹分析，发现生物膜基质中存在细胞游离形式的 CdrA，包括 LapG 和 LasB 酶解产生的片段。LasB 存在于细胞游离基质中且具有活性，其酶切 CdrA 的位点在 CdrA 的重复区域，这可能导致产生多个 CdrA 片段。
4. 细胞游离的 CdrA 具有功能并足以支持生物膜聚集体生长：构建 CdrA 的截短形式 CdrA^trc，发现其能保留在生物膜基质中，并能促进生物膜聚集体的形成和 Psl 的保留，尽管效果不如野生型 CdrA。此外，LasB 的表达虽会导致 CdrA 酶解，但酶解后的 CdrA 仍保留在生物膜基质中且保持功能，同时持续的 CdrA 产生对其在生物膜基质中的保留并非必需。

研究讨论

本研究表明铜绿假单胞菌生物膜基质存在动态变化，包括基质材料的持续合成和周转。新产生的 Psl 在生物膜聚集体外周沉积，这一现象与之前的一些研究结果相符，但与利用psl转录报告基因的研究结果存在差异，推测可能与代谢或信号通路有关。同时，CdrA 的酶解产物在生物膜中具有功能，细胞相关基质在生物膜早期成熟中起重要作用，而细胞游离和降解的基质成分在后期足以支持生物膜聚集体的生长。此外，本研究还发现霍乱弧菌生物膜也存在类似的 EPS 沉积现象，表明基质动态变化与聚集体生长的关系可能在不同物种间保守。生物膜基质的重塑与真核细胞外基质（ECM）的重塑相似，可能是调节细胞 - 细胞和细胞 - 基质相互作用的一种方式，这为深入理解生物膜的形成和发展机制提供了新的视角，也为开发抗生物膜策略提供了理论基础。