改写 RNA 命运的神奇 “开关”：PPR - DYW:KP 蛋白的 RNA 编辑密码大揭秘

为探究 PPR - DYW:KP 蛋白 RNA 编辑机制及 Lys88 作用，研究人员开展相关研究。结果发现 Lys88 对 U - to - C 编辑至关重要，且 DYW 域修饰可影响编辑反应。这一成果助力深入理解 RNA 编辑，为相关研究提供新思路，值得一读。

　　

在神奇的植物世界里，细胞中的 RNA 编辑就像是一位技艺高超的 “分子工匠”，默默地对基因表达进行着精细调控。植物细胞器（细胞中具有特定功能的微小结构）中的 RNA 编辑，能够修复基因序列，创造起始密码子或者去除终止密码子，就像给基因表达这出 “大戏” 调整剧本，让它能够顺利上演。在众多 RNA 编辑反应中，胞苷脱氨反应最为常见，也就是把胞苷（C）变成尿苷（U）（C-to-U），这个过程由 PPR（pentatricopeptide repeat，五肽重复序列）蛋白催化完成，PPR 蛋白凭借其 PPR 结构域识别目标 RNA 序列，再利用 C 端的 DYW 结构域进行脱氨反应。

随着研究的深入，科学家们发现了 DYW 结构域的两个不同亚类：DYW:PG 和 DYW:KP。DYW:PG 结构域广泛存在于所有陆地植物分支中，主要负责催化 C-to-U 编辑反应，在被子植物（开花植物）中的研究已经比较深入。而 DYW:KP 结构域则相对神秘，它仅存在于特定的早期陆地植物分支中，与细胞器中的尿苷到胞苷（U-to-C）编辑反应相关。虽然有证据表明 KP 蛋白参与了植物细胞器中的 U-to-C RNA 编辑，但天然 KP 蛋白的活性一直不为人知。此外，之前有研究利用基于天然蛋白保守序列设计的人工 KP 蛋白（如 KP2、KP3 和 KP6），在细菌和人类细胞中实现了 U-to-C 编辑，其中 KP6 在人类细胞中还表现出 C-to-U 编辑活性，并且这种活性在体外会受到羧酸的刺激。U-to-C 编辑机制涉及交联反应，需要在提取 RNA 前进行蛋白酶处理才能检测到。有研究认为，DYW:KP 蛋白活性位点中的保守赖氨酸（Lys88）会与编辑的尿苷交联，对 U-to-C 编辑至关重要，但这个机制仍有许多未知之处。

为了深入了解 KP6 这种神奇蛋白的双重编辑活性背后的机制，来自相关研究团队的科研人员在《Scientific Reports》期刊上发表了题为 “Engineered PPR-DYW:KP proteins reveal determinants of RNA editing specificity and reaction type” 的论文。他们通过一系列实验，揭示了 Lys88 在 U-to-C 编辑活性中的关键作用，还发现对 DYW 结构域进行细微修饰，就能影响编辑核苷酸的位置和 RNA 编辑反应的类型，这一发现为深入理解 RNA 编辑机制打开了新的大门。

科研人员为了开展这项研究，用到了几个关键的技术方法。首先是定点突变技术，通过这种技术在 KP 蛋白的相关结构域或 rpoA 编辑位点引入突变；接着利用 RNA 提取和 cDNA 合成技术，从细胞中获取 RNA 并将其转化为 cDNA；然后借助 PCR 扩增技术对编辑位点进行扩增；还有测序技术，用于分析编辑位点的序列；另外，使用定量分析软件 MultiEditR 对 RNA 编辑进行量化；最后运用荧光显微镜和图像分析软件，通过检测 GFP 荧光来评估编辑对翻译的影响 。

下面让我们一起看看科研人员都有哪些重要的研究发现。

KP6 蛋白独特的编辑活性

科研人员把目光聚焦在 KP6 蛋白上，它能编辑拟南芥 rpoA 编辑位点，在人类细胞中同时具备 C-to-U 和 U-to-C 编辑活性，是个研究的好对象。为了深入了解 U-to-C 编辑机制以及赖氨酸交联在其中的作用，科研人员决定设计只具有单一编辑活性的 KP6 变体。他们对 DYW 结构域中的氨基酸位点进行突变，使其与从藓类、石松类和蕨类植物中鉴定出的 133 个氨基酸的 DYW:KP 结构域的保守序列对齐。之后，在人类胚胎肾（HEK）293T 细胞中，分析了 45 个突变体对 rpoA 编辑位点的编辑活性。这个编辑位点根据研究目的，要么是 C（用于研究 C-to-U 编辑），要么是 U（用于研究 U-to-C 编辑）。结果发现，有五个突变体的 U-to-C 编辑活性显著高于 C-to-U 活性，例如 L6C、V17T、D47E、D116A 和 I119V 突变。科研人员挑选出其中四个编辑效率差异最大的突变，构建了双突变和三突变体。像 L6C-V17T-I119V 和 L6C-D116A-I119V 这两个三突变体，U-to-C 编辑效率分别约为 62% 和 89%，几乎没有明显的 C-to-U 编辑活性。同时，也有一些突变体表现出高 C-to-U 编辑活性，比如 E64G、L113V 和 F133H 突变。科研人员基于此构建出只具有显著 C-to-U 编辑活性的变体，如 E64G-L113V、E64G-F133H 和 E64G-L113V-F133H，编辑效率分别约为 57%、38% 和 59%。最后，科研人员选择 L6C-D116A-I119V（命名为 KP6u）和 E64G-L113V-F133H（命名为 KP6c）这两个变体进行后续研究。通过对这些变体的研究，科研人员成功获得了具有独特编辑活性的 KP6 蛋白，为后续探究编辑机制奠定了基础。

Lysine 88 对 KP 变体 U-to-C 编辑活性至关重要

科研人员通过序列比对发现，在所有 DYW:KP 结构域中，只有 88 位的赖氨酸（Lys88）是保守的。为了探究它在 U-to-C 反应中的重要性，科研人员把 Lys88 突变成丙氨酸（K88A），或者其他带有氨基、性质相似的氨基酸（如半胱氨酸 K88C、组氨酸 K88H、天冬酰胺 K88N、谷氨酰胺 K88Q 和精氨酸 K88R ）。结果令人惊讶，这个突变使得 KP6 和 KP6u 的 U-to-C 编辑活性消失了。对于 KP6、KP6u 和 KP6c 来说，K88A、K88C、K88N 和 K88Q 突变让 C-to-U 编辑活性接近 100%。而用其他碱性氨基酸替代赖氨酸时，对 C-to-U 活性的影响各不相同，K88H 突变时约为 55 - 65%，K88R 突变时则在 0 - 25% 之间。科研人员在 KP2 和 KP3 中把 Lys88 突变成丙氨酸，也证实了它在 U-to-C 编辑活性中的关键作用。不过，KP2-K88A 和 KP3-K88A 突变体的 C-to-U 编辑活性比 KP6-K88A 变体要低一些，这说明 KP2 和 KP3 的氨基酸序列可能更适合 U-to-C 编辑。这一系列实验充分表明，Lys88 位于活性位点，对 U-to-C 编辑起着不可或缺的作用，而且 88 位氨基酸的性质（比如大小）还会直接影响 C-to-U 编辑活性。

KP-K88A 突变蛋白不影响翻译

之前有研究提出，赖氨酸和编辑后的核苷酸之间的交联会阻碍 RNA 分子的释放。为了探究 K88A 突变对 RNA 释放的影响，科研人员对比了蛋白酶 K 处理和未处理情况下蛋白的编辑效率。结果发现，KP3、KP6 和 KP6u 在未经过蛋白酶处理时，U-to-C 编辑效率很低或者没有，而 KP6、KP6c 和所有 K88A 变体在有无蛋白酶处理时，C-to-U 编辑效率没有明显差异，这表明 Lys88 对 U-to-C 编辑活性很重要，还会影响编辑后的 RNA 在人类细胞中的释放。为了进一步验证在没有交联的情况下，C-to-U 编辑活性不会阻碍翻译，科研人员在 rpoA 结合位点下游和 GFP 编码序列上游创建了起始密码子，然后检测细胞中 GFP 的积累情况。结果发现，野生型蛋白不能编辑目标位点，而 K88A 突变体可以。而且，除了 KP3-K88A，其他 K88A 突变体的 GFP 积累量都显著增加，这意味着在没有交联的情况下，K88A 变体不会影响编辑后的 RNA 分子释放用于翻译。不过，不同 DYW:KP 结构域氨基酸序列的差异可能会对这个过程产生影响。

K88A 降低核苷酸偏好性并影响编辑特异性

科研人员之前发现 KP2、KP3 和 KP6 蛋白对嘌呤（一种碱基）在 -1 位（相对于编辑位点）的核苷酸偏好性较低。为了探究 K88A 突变对核苷酸偏好性的影响，他们把编辑位点 -1 位的核苷酸换成其他三种核苷酸，然后分析新设计的 C-to-U KP 变体的编辑效率。结果发现，KP6c 对嘧啶（另一种碱基）有偏好，编辑效率比嘌呤高 2 - 3 倍，而 KP-K88A 变体几乎没有这种偏好，这可能是因为它们的编辑效率较高。这说明 KP-K88A 能够编辑起始密码子，可能是因为活性增强，而不是核苷酸偏好性发生了改变。科研人员还研究了 K88A 突变对编辑窗口内脱靶编辑的影响，他们把编辑位点上下游的两个核苷酸都换成胞嘧啶。结果发现，KP6、KP6c 和 KP3 只编辑目标核苷酸，而 KP6u 和 KP2 会编辑 +1 位的核苷酸，编辑效率分别约为 8% 和 25%，这表明 K88A 突变可能会影响对目标核苷酸的特异性识别。

从这次的研究中可以得出结论，科研人员成功设计出了分别增强 U-to-C 或 C-to-U 编辑活性的 KP6 突变体。通过构建预测结构模型发现，一些氨基酸残基的替换会影响活性位点的结构，进而改变碱基编辑的方向。Lys88 在 KP 结构域的 U-to-C 编辑活性中起着关键作用，它是活性中心的重要组成部分。K88A 突变会导致局部脱靶编辑，降低 -1 位的核苷酸特异性，还会改变活性中心的结构。这一研究意义重大，它让我们对 RNA 编辑机制有了更深入的理解，为未来进一步研究植物细胞器中的基因表达调控提供了重要线索。而且，研究结果也为开发更精准的 RNA 编辑工具提供了理论基础，或许在未来，我们可以利用这些知识，更精确地调控基因表达，在农业生产、医学研究等领域发挥重要作用。