揭秘龋齿 “幕后黑手”：变形链球菌基因组差异与龋齿风险的深度探索

为解决成人龋齿相关问题，伊斯坦布尔大学牙科学院的研究人员开展变形链球菌基因组研究。他们对比高低龋齿风险者菌株基因组，发现基因差异。该研究有助于理解龋齿机制，为预防策略提供依据，值得科研读者一读。

　　

在我们的口腔中，有一种细菌正悄无声息地影响着我们的牙齿健康，它就是变形链球菌（Streptococcus mutans）。这种细菌被认为是龋齿的主要微生物病因，它就像一个隐藏在口腔里的 “小恶魔”，凭借着合成细胞外多糖、在牙齿组织中形成生物膜基质、代谢各种碳水化合物产生有机酸以及在低 pH 值环境下生存的能力，一步步侵蚀着我们的牙齿 。

变形链球菌的主要致病因素包括黏附、产酸（acidogenesis，产生有机酸的过程 ）和耐酸（aciduricity，在酸性环境下生存的能力）。这些因素相互配合，改变口腔生物膜的物理化学性质，使得变形链球菌以及其他产酸和耐酸的细菌在口腔中大量繁殖。变形链球菌还能感知细胞内和细胞外环境的变化，并通过调节基因转录来适应环境，进而表达出致病因子，对我们的牙齿发起攻击。

奇怪的是，即使有些人从来没有得过龋齿，在他们的口腔中也能检测到变形链球菌。这就引发了科学家们的思考：比较有广泛龋齿和没有龋齿的人，他们口腔中变形链球菌的基因突变和基因存在与否的差异，会不会是揭开龋齿发病机制的关键呢？近年来，新一代测序技术的发展为研究提供了有力的工具，通过全基因组测序分析，能够探索基因的结构变化、重复区域、DNA 甲基化信息以及以前未测序的区域。

然而，之前关于变形链球菌基因组的临床研究大多集中在儿童群体，主要研究患有严重儿童早期龋齿（severe early childhood caries，S-ECC ）的儿童。但大家知道吗，儿童和成年人的口腔微生物群控制机制、龋齿风险因素是不同的，在临床环境中龋齿的发展进程也不一样。所以，这些已有的研究并不能完全反映普通人群的龋齿问题，这就迫切需要开展针对成年人的新研究。

为了解开这些谜题，来自伊斯坦布尔大学牙科学院的研究人员在《Scientific Data》期刊上发表了一篇名为 “Genome resequencing and comparative analysis of Streptococcus mutans isolates obtained from patients with high and low caries risk” 的论文。研究人员通过对从高龋齿风险和无龋齿的成年人唾液中分离出的变形链球菌菌株进行全基因组测序和比较分析，发现了一些与龋齿相关的基因特征，这对于理解变形链球菌在龋齿发生中的作用，以及开发新的龋齿预防策略具有重要意义。

研究人员为了开展这项研究，用到了几个关键的技术方法。首先是全基因组测序技术，它能测定出细菌基因组的全部 DNA 序列。其次是突变分析技术，通过特定的程序和参考菌株基因组，找出样本中的基因突变。还有泛基因组分析技术，利用这个技术可以确定检测到的基因在不同样本中的存在或缺失情况 。

下面我们来详细看看研究人员都发现了什么。

一、研究设计

研究人员在伊斯坦布尔大学牙科学院开展了这项研究，招募的参与者分为实验组和对照组，且都没有全身性疾病。实验组是龋齿高发人群，对照组则是年龄相仿的无龋齿人群。在研究开始前，研究人员获得了伊斯坦布尔大学牙科学院临床研究伦理委员会的批准，并得到了所有参与者的自愿知情同意。这就像是给研究上了两把 “安全锁”，确保研究在合法、尊重参与者的前提下进行。

二、临床检查和样本收集

为了全面了解志愿者的口腔健康状况，研究人员制作了一份详细的综合病历表，记录了他们的年龄、性别、DMFT（Decayed, Missing, Filled Teeth，即龋齿、缺失牙、补牙的数量 ）指数、口腔卫生指数、龋齿高危指标和保护因素。然后，收集志愿者的刺激性唾液样本，用来评估龋齿风险，并进行龋齿活动测试。这一系列操作就像给志愿者的口腔健康做了一次全方位的 “体检”。

三、龋齿风险分析

研究人员利用 Cariogram 应用程序，根据实验室测试和病历数据计算出每个志愿者的个人龋齿风险。之后，按照龋齿风险的高低，把志愿者分为两组：高和极高龋齿风险的人被归为实验组，低和极低龋齿风险的人则进入对照组。这样分组后，研究人员就能更有针对性地对比不同龋齿风险人群口腔中的变形链球菌了。

四、变形链球菌的分离

样本收集好了，接下来就是分离变形链球菌。研究人员采用定量培养技术，把唾液样本进行十倍稀释后，接种到 Mitis Salivarius Bacitracin（MSB）琼脂培养基上。然后把接种好的培养皿放在 37°C、含 5 - 7% 二氧化碳的环境中培养 48 小时。培养结束后，用放大镜数出 MSB 琼脂表面不透明、粗糙的菌落数量，计算出菌落形成单位（cfu/ml），从而确定唾液中变形链球菌的水平。从单个菌落中分离出的菌株，会在 Brain Heart Infusion（BHI）琼脂上进行传代培养，之后保存在 - 20°C 的环境中，准备用于后续的 PCR 分析。这一步就像是从众多细菌 “大军” 中，精准地找到了变形链球菌这个 “目标敌人”。

五、PCR 分析、DNA 分离和全基因组测序

研究人员从 40 个在选择性培养基上生长的临床样本分离株和 1 个从美国典型培养物保藏中心获得的变形链球菌 ATCC 25175 分离株中提取 DNA。提取 DNA 使用的是 High Pure PCR Template Preparation Kits 试剂盒，按照试剂盒的操作说明进行。提取出的 DNA 会保存到 - 20°C。之后，用物种特异性引物进行 PCR 确认，看看这些菌株是不是真的变形链球菌。确认无误后，对符合质量控制参数的 DNA 样本，用 “Illumina DNA Prep kit” 试剂盒进行处理，在 Illumina NextSeq. 2000 仪器上进行测序，得到 2×150bp 的测序读长。测序得到的原始数据会以 FASTQ 格式保存。这一系列操作就像给变形链球菌做了一次 “基因身份证” 的制作，把它的基因信息记录下来。

六、测序数据处理

原始测序数据拿到手后，研究人员先用 CASAVA 数据分析软件去除测序接头，并进行数据解复用。接着，用 FASTQC 和 MultiQC 软件对原始测序数据进行质量控制，检查读长数量和序列质量分数。之后，使用 Unicycler v0.5.0 软件，按照默认参数对每个样本进行从头基因组组装。组装好的基因组会用于后续分析，比如用 autoMLST 程序进行多位点序列分型（MLST）分析，看看组装的序列片段是不是属于变形链球菌，不是的话就会被排除掉。最后，研究人员还会选择不同地理区域的变形链球菌基因组序列，和自己组装的序列进行比较，计算基因组间的距离，绘制系统发育树。这就像是把变形链球菌的基因信息进行整理、分类，绘制出它们的 “家族族谱”。

七、突变分析

为了找出样本中的基因突变，研究人员用 Snippy v4.6.0 程序，以 ATCC 25175 参考菌株基因组为参照，对原始 FASTQ 数据进行分析。分析得到的变异信息会写入 VCF 文件，并用 bcftools v1.18 程序进行合并。然后，用 Snpeff v4.3 程序确定每个突变对基因或蛋白质的影响，并制作出包含所有突变信息的表格。通过这个表格，研究人员使用 Fisher 精确检验，对比实验组和对照组中每个突变的出现频率，计算出 p 值，p 值小于 0.05 的就被认为具有统计学意义。这一步就像是在变形链球菌的基因信息里 “找茬”，找出那些可能和龋齿有关的基因突变。

八、泛基因组分析

研究人员对分离株的从头组装基因组进行泛基因组分析，看看检测到的基因在不同样本中的存在或缺失情况。他们先用 Prokka v1.14.6 程序确定基因或蛋白质序列，再用 “Roary: the Pan Genome Pipeline” v3.13.0 程序对得到的蛋白质序列和注释进行分析，把相似性达到 90% 的氨基酸序列聚成一类，确定这些基因在样本中的存在或缺失状态，找出所有样本都含有的核心基因。之后，根据所有检测到的基因的存在或缺失状态绘制系统发育树，用 Scoary v1.6.16 程序对比实验组和对照组中基因的出现频率，计算出 p 值，p 值小于 0.05 的就认为具有统计学意义。这就像是给变形链球菌的基因进行一次 “大普查”，看看哪些基因在不同样本中是 “常住居民”，哪些是 “流动人口”。

通过这些研究，研究人员得出了不少重要结论。在对 26 个样本（包括 25 个临床分离株和 ATCC 25175 菌株的基因组序列）进行泛基因组分析时，共检测到 2904 个编码基因序列，其中 1563 个是核心基因。在所有检测到的基因中，只有四种不同形式的羊毛硫抗生素 mutacin - 1140（lanA）基因中的一种，在实验组和对照组中的存在比例有显著差异（p = 0.03 ）。研究人员还发现，以所有样本中鉴定出的基因的氨基酸序列为依据，lanA基因有四种不同的基因序列，相似度至少达到 90%。其中一种基因序列在实验组的五个分离株中存在，而对照组中没有。

在突变分析方面，以 ATCC 25175 基因组为参考，在所有样本中总共检测到 50584 个基因突变。这些突变中，47% 是同义突变，31% 是错义突变，21% 位于基因间区域。而且，研究人员发现实验组和对照组中 67 个突变的存在与否比例有统计学差异（p ＜ 0.05 ）。

这些研究结果意义重大。它让我们对变形链球菌的基因组特征有了更深入的了解，知道了哪些基因可能和龋齿的发生相关。比如lanA基因的差异，可能为我们开发新的龋齿预防策略提供了新的靶点。而且，研究人员还构建了系统发育树，从进化的角度展示了不同变形链球菌菌株之间的关系，这有助于我们进一步探究变形链球菌的遗传多样性和进化规律。这项研究就像是一把钥匙，为我们打开了理解变形链球菌与龋齿关系的大门，也为未来预防和治疗龋齿的研究指明了方向，说不定在不久的将来，我们就能根据这些研究成果，找到更有效的预防龋齿的方法，让大家都能拥有健康洁白的牙齿。