FADD 的 SUMO 化修饰竟成缺氧性心血管病关键 “密码”，有望开辟全新治疗路径

为解决缺氧介导血管内皮细胞损伤机制不明等问题，重庆医科大学研究人员开展 FADD 的 SUMO 化修饰在缺氧诱导血管内皮细胞坏死性凋亡中作用的研究。结果发现其促进坏死性凋亡，GA 可减轻损伤。该研究为相关心血管病治疗提供新靶点，值得一读。

　　

在人体的心血管系统里，血管内皮细胞（Vascular Endothelial Cells，简称 ECs）可是个 “大忙人”，它是心血管系统中数量最多的细胞类型，就像血管的 “守护者” 一样，直接接触着血液和各种物质，对维持血管的正常功能起着关键作用。然而，当身体处于缺氧（Hypoxia）状态时，这位 “守护者” 就麻烦了。缺氧可不是个小问题，它与许多疾病都有关系，比如大脑、心脏、肝脏和肾脏等器官的缺血性损伤，在这些疾病发生时，氧气供应不足，会给细胞带来很大的压力。

对于血管内皮细胞来说，缺氧会导致它功能失调甚至死亡，进而引发血管病变，这在心血管疾病的发展过程中起着重要作用。但是，一直以来，科学家们对缺氧介导血管内皮细胞损伤的分子调控机制了解得并不清楚。就像在黑暗中摸索，虽然知道这个问题很重要，但却找不到关键的线索。

同时，坏死性凋亡（Necroptosis）作为一种新型的程序性细胞死亡方式，也逐渐进入了科学家们的视野。它与缺氧有着密切的联系，比如抑制坏死性凋亡可以改善缺氧介导的视网膜新生血管生成，还能减轻缺氧性脑损伤和缺血性脑损伤。但是，坏死性凋亡在缺血缺氧性血管内皮损伤的发病机制中到底扮演着怎样的角色，却没有人深入研究过。

还有 FADD（Fas - associated via death domain）蛋白，它在细胞死亡的调控中可是个 “神秘角色”。它不仅参与细胞凋亡（Apoptosis），还在坏死性凋亡中发挥作用。不过，它在不同的模型中表现出不同的作用，有时促进坏死性凋亡，有时又抑制它，这让科学家们很困惑，它在缺氧诱导的坏死性凋亡中的具体作用和分子机制还亟待探索。

另外，SUMO 化修饰（SUMOylation）作为一种蛋白质的翻译后修饰方式，也引起了科学家们的注意。它和泛素化修饰（Ubiquitination）有些相似，但功能却不一样。SUMO 化修饰可以影响蛋白质的稳定性、蛋白质之间的相互作用以及蛋白质在细胞内的定位。已知 FADD 蛋白有 SUMO 化修饰位点，可 SUMO 化修饰对 FADD 蛋白功能的影响，以及它在缺氧诱导的内皮损伤中的作用，还是个未知数。

为了弄清楚这些问题，重庆医科大学的研究人员在《Cell Death and Disease》期刊上发表了一篇名为 “FADD SUMOylation promotes hypoxia - induced necroptosis in vascular endothelial cells” 的论文。通过一系列研究，他们发现缺氧会诱导血管内皮细胞发生坏死性凋亡，并加剧炎症损伤。FADD 是缺氧介导的坏死性凋亡的关键调节因子，SUMO 化修饰通过影响 FADD 的蛋白质构象，抑制其泛素化，增加其蛋白质稳定性和水平，还能促进 FADD 与 RIPK1 和 RIPK3 的结合，形成 FADD - RIPK1 - RIPK3 复合物，从而促进血管内皮细胞的坏死性凋亡。此外，SUMO 化修饰抑制剂银杏酸（Ginkgolic Acid，简称 GA）可以显著减轻缺氧诱导的血管内皮损伤和炎症反应。这一研究揭示了 FADD 的 SUMO 化修饰在缺氧介导的内皮细胞坏死性凋亡中的新机制，为缺氧相关心血管疾病的治疗提供了潜在的靶点，就像在黑暗中找到了一盏明灯，为后续的研究和治疗指明了方向。

在这项研究中，研究人员用到了几个关键的技术方法。他们构建了动物和细胞缺氧模型，通过将小鼠置于缺氧环境以及对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）进行缺氧干预，模拟体内外的缺氧状态。还使用了蛋白质免疫印迹（Western blot）技术，来检测各种蛋白质的表达水平；免疫荧光（Immunofluorescence assay）技术，观察蛋白质在细胞和组织中的定位；RNA 逆转录定量聚合酶链反应（RT - qPCR）技术，检测基因的表达变化；还有免疫沉淀（Immunoprecipitation）技术，研究蛋白质之间的相互作用等。这些技术就像是研究人员的 “秘密武器”，帮助他们一步步揭开缺氧与血管内皮细胞损伤之间的神秘面纱。

下面我们来看看具体的研究结果。

缺氧介导血管内皮损伤并伴有炎症反应

研究人员先构建了 C57BL/6 小鼠的体内缺氧模型，把小鼠放在氧气浓度为 10% 的动物缺氧舱里，分别持续 1、2、3、4 周。他们发现，从第 3 周开始，小鼠主动脉血管中的 TUNEL?细胞数量就逐渐增加，而且这些 TUNEL?细胞主要集中在血管内皮。同时，缺氧 4 周还会显著增加血管炎症，通过 IL - 1β 免疫荧光观察发现，血清中 IL - 1β 和 TNFα 的水平也明显升高。在体外实验中，对 HUVEC 进行缺氧干预后，发现 TNFα 的表达在缺氧 12 小时达到峰值，其他炎症因子 IL - 1β、ICAM、VCAM 的蛋白表达在缺氧 6 小时后达到峰值。这些结果表明，缺氧会导致血管内皮细胞功能失调和死亡，就像给血管的 “守护者” 带来了一场灾难，让血管陷入了危险之中。

缺氧诱导血管内皮细胞发生坏死性凋亡

因为发现缺氧会增加血管内皮细胞中 TUNEL?水平，研究人员就进一步用 CCK8 法检测 HUVEC 的细胞活力。结果发现，缺氧会以时间依赖的方式显著抑制细胞活力。他们还用了各种抑制剂进行实验，发现 RIPK1 激酶抑制剂 Nec - 1 和抗氧化剂 NAC 可以部分阻止缺氧（48 小时）诱导的细胞死亡，Nec - 1 还能显著减少缺氧（48 小时）处理后的坏死细胞。通过透射电子显微镜（TEM）观察，发现缺氧（12 小时）后的 HUVEC 出现了典型的坏死性凋亡细胞形态结构，比如细胞质透明化、细胞质内容物丢失、细胞膜不完整等。同时，坏死性凋亡激活标志物 p - RIPK3/RIPK3 和 p - MLKL/MLKL 从缺氧 6 小时开始逐渐增加，而且这些结果都能被 Nec - 1 预处理有效逆转。在体内实验中，对小鼠主动脉血管切片进行 p - MLKL/CD31 免疫荧光检测，发现 p - MLKL 在血管内皮细胞中积累更多，缺氧 4 周后，小鼠主动脉血管中 p - MLKL/MLKL 和炎症因子（TNFα、IL - 1β）的表达也显著增加。这些结果进一步证实，缺氧会促进坏死小体的形成，激活坏死性凋亡途径，从而导致内皮损伤，就像在血管内皮细胞里点燃了一把 “死亡之火”。

FADD 参与缺氧条件下内皮细胞的坏死性凋亡

以前的研究表明 FADD 在不同模型中对坏死性凋亡有不同的调节作用。在这项研究中，研究人员发现缺氧（12 小时）会通过共免疫沉淀（co - IP）增加 FADD 与 RIPK1/RIPK3 的相互作用，这表明 FADD 参与了坏死性凋亡。为了进一步研究 FADD 在缺氧介导的内皮细胞坏死性凋亡中的具体作用，他们用靶向 FADD 的 siRNA 与 HUVEC 共孵育 48 小时后再进行缺氧处理，发现 FADD 基因敲低可以显著恢复缺氧诱导的 HUVEC 细胞活力，减少坏死细胞，还能显著抑制 p - RIPK3 和 p - MLKL 的水平。相反，用靶向 FADD 的质粒与 HUVEC 共孵育 48 小时后再缺氧，发现 FADD 过表达会显著增加 p - MLKL 和 p - RIPK3 的水平。这些数据说明，FADD 在调节缺氧内皮细胞的坏死性凋亡中起着至关重要的作用，就像一个 “开关”，控制着细胞的生死走向。

缺氧促进 FADD SUMO 化修饰，从而增加其蛋白质稳定性

研究人员想弄清楚 FADD 介导坏死性凋亡的机制，就把目光聚焦在 FADD 的表达变化上。他们发现，缺氧 12 小时后，HUVEC 中 FADD 的蛋白质水平显著增加，在体内实验中，缺氧 4 周也会使 FADD 蛋白质水平明显升高。有趣的是，缺氧 12 小时后 FADD 的 mRNA 水平并没有变化，这说明缺氧可能是通过影响蛋白质稳定性，而不是转录活性来调节 FADD 的表达。为了验证这个假设，他们用蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺（CHX）分析蛋白质降解速率，发现缺氧（12 小时）会延长 FADD 蛋白质的半衰期。而且，用自噬激活剂雷帕霉素处理也不会影响 FADD 蛋白质水平，这进一步表明缺氧诱导的 FADD 增加不是由自噬相关途径介导的。

考虑到翻译后修饰在调节蛋白质稳定性中的重要性，研究人员重点研究了 FADD 的修饰。他们发现缺氧（12 小时）会增强 HUVEC 中 FADD 与 SUMO2/3 的相互作用。为了确定 SUMO 化修饰是否影响 FADD 的蛋白质稳定性，他们构建了 FADD 的 SUMO 化修饰位点突变质粒，将野生型 FADD（FADD - OE WT）或突变型 FADD（FADD - OE MUT）质粒转染到 HUVEC 细胞中。结果发现，FADD - OE（WT）质粒在缺氧（12 小时）下能显著延长 FADD 蛋白质的半衰期，而 FADD - OE（MUT）质粒则阻止了缺氧诱导的 FADD 蛋白质半衰期延长。用 SUMO 化修饰抑制剂银杏酸（GA）处理，会降低 FADD 蛋白质水平，缩短缺氧（12 小时）下 FADD 蛋白质的半衰期。通过分子对接分析，发现 SUMO 化修饰的 FADD 会掩盖其泛素化位点，抑制其泛素化，而且缺氧（12 小时）下 FADD 的泛素化水平显著降低，FADD - OE（MUT）质粒能恢复其泛素化水平。这些结果表明，缺氧（12 小时）会促进 HUVEC 中 FADD 的 SUMO 化修饰，通过抑制泛素化来增强其蛋白质稳定性，就像给 FADD 穿上了一件 “稳定铠甲”。

SUMO 化修饰的 FADD 增加其与 RIPK1 和 RIPK3 的结合，从而促进坏死性凋亡

以前的研究表明 FADD 可以参与坏死小体的形成，促进坏死性凋亡。研究人员推测 SUMO 化修饰的 FADD 会影响其与 RIPK1 的相互作用，调节坏死性凋亡。他们在 HUVEC 中用 FADD - OE（MUT）质粒处理，发现可以显著抑制缺氧（12 小时）下 p - MLKL 和 p - RIPK3 的表达，共免疫沉淀结果也显示，突变 FADD 的 SUMO 化修饰位点会显著减少坏死小体的形成。用 SUMO 化修饰抑制剂 GA 处理，也能有效抑制缺氧诱导的 p - RIPK3/RIPK3 和 p - MLKL/MLKL 的表达，TEM 图像显示 GA 处理能明显减少坏死性凋亡细胞的数量。FADD - OE (WT) 质粒处理会显著降低细胞活力，增加细胞毒性，而 FADD - OE（MUT）质粒则不会像 FADD - WT 过表达那样导致大量细胞死亡或坏死，GA 预处理能有效恢复细胞活力，减少坏死细胞。

接下来，研究人员探究 FADD 与 RIPK1/3 的相互作用是否依赖于其 SUMO 化修饰。共免疫沉淀结果显示，FADD - OE（WT）质粒在缺氧（12 小时）下会诱导 FADD 与 RIPK1/3 的相互作用，而突变 SUMO 化修饰位点则会显著降低这种相互作用。分子对接分析发现，SUMO 化修饰的 FADD（FADD - SUMO）与 RIPK1 的死亡结构域（RIPK1 - DD）形成的复合物更稳定，而 FADD 突变体与 RIPK1 形成的复合物则更不稳定，相互作用接触面积减小，结合自由能升高，氢键数量减少。SUMO 还通过与 RIPK1 形成氢键，促进 FADD 与 RIPK1 的相互作用，稳定 FADD - SUMO - RIPK1 复合物。这些结果表明，SUMO 化修饰的 FADD 会增加其与 RIPK1/3 的结合，从而介导坏死性凋亡，就像给坏死性凋亡的 “发动机” 加了一把劲。

SUMO 化修饰抑制剂 GA 改善缺氧诱导的血管内皮损伤和炎症反应

既然 SUMO 化修饰会通过 FADD 促进缺氧诱导的坏死性凋亡，研究人员就想看看抑制 SUMO 化修饰能不能减轻内皮损伤。他们用 GA 对缺氧处理的小鼠进行干预，给缺氧处理 1 周后的 C57BL/6 小鼠，每两天灌胃一次浓度为 10mg/ml 的 GA，持续 3 周。结果发现，GA 处理的缺氧小鼠主动脉血管切片中，TUNEL?细胞和 IL - 1β 的积累减少，血清中 TNFα 和 IL - 1β 的水平降低，GA 还能显著降低缺氧诱导的主动脉血管组织中炎症因子的表达和 MLKL 的磷酸化水平，减少小鼠主动脉血管中 ICAM - 1 的水平，减轻肝脏和脾脏的器官损伤。这些结果表明，GA 可以通过抑制坏死性凋亡和炎症反应，保护缺氧诱导的血管内皮损伤，就像给缺氧受损的血管 “包扎伤口”。

在讨论部分，研究人员提到，缺氧是许多疾病中的一个重要因素，比如在动脉粥样硬化中，缺氧会导致血管病变和炎症反应，但缺氧诱导血管病变和坏死性凋亡激活的具体机制以前并不清楚。他们的研究发现，坏死性凋亡可能是缺氧内皮损伤的重要原因，SUMO 化修饰的 FADD 在这个过程中起着关键作用，这为缺氧相关疾病的治疗提供了新的潜在靶点。

坏死性凋亡虽然参与和调节多种疾病，但在缺氧介导的血管内皮损伤中的研究还很少。他们的研究证明了缺氧会诱导血管内皮细胞发生坏死性凋亡，导致内皮功能障碍，还发现炎症因子在缺氧后的血管组织和血清中产生，可能是因为血管内皮细胞坏死性凋亡释放的炎症因子激活了平滑肌细胞的炎症信号，但缺氧诱导内皮细胞坏死性凋亡的主要因素还需要进一步探索。

FADD 作为一个关键的桥接蛋白，在不同研究中对坏死性凋亡的作用不一致，在这项研究中，它在缺氧介导的内皮细胞坏死性凋亡中起促进作用，这可能与缺氧下 caspase 8 活性降低，使 FADD 与 RIPK1/RIPK3 形成复合物有关。

SUMO 化修饰在缺氧相关疾病中很重要，但 FADD 的 SUMO 化修饰对其蛋白质功能和缺氧诱导的内皮损伤的影响以前未知。这项研究表明，SUMO 化修饰的 FADD 会增加蛋白质稳定性，促进坏死性凋亡。同时，SUMO 化修饰和泛素化修饰对蛋白质功能的影响存在争议，在 FADD 中它们是竞争关系，SUMO 化修饰的 FADD 会掩盖泛素化位点，增加蛋白质稳定性，但研究没有探究具体是哪个 E3 连接酶在 SUMO 化修饰过程中起作用。

此外，研究人员还发现，抑制 SUMO 化修饰可以减轻缺氧小鼠主动脉血管内皮的炎症损伤和坏死性凋亡，为缺氧相关疾病的治疗提供了一种可能的策略，比如使用 GA。虽然 GA 抑制坏死性凋亡的具体机制还需要进一步研究，不知道是其抗炎作用还是抑制 SUMO 化修饰的作用，但这一发现为临床治疗带来了新的希望。

总的来说，这项研究揭示了 FADD 的 SUMO 化修饰在缺氧介导的血管内皮细胞坏死性凋亡中的重要作用，为内皮损伤的治疗提供了新的靶点，也为缺氧相关心血管疾病的研究和治疗开辟了新的道路，就像在医学研究的道路上点亮了一盏新的明灯，让我们对这些疾病有了更深入的认识，也为未来的治疗带来了更多的可能。