CLDN6 与铁死亡 “联手”，为乳腺癌预后及治疗指引新方向

为解决 CLDN6 在乳腺癌铁死亡中的作用机制及预后预测问题，研究人员开展相关研究。结果发现 CLDN6 与铁死亡相关，能触发 NRF2 介导的铁死亡。该研究为乳腺癌预后预测和治疗提供重要依据，值得科研读者一读。

　　

在癌症研究的广阔领域中，铁死亡（ferroptosis）作为一种独特的调节性细胞死亡方式，逐渐成为了众人瞩目的焦点。它由铁依赖的致命脂质过氧化物驱动，对肿瘤的生长和发展有着重要影响。在乳腺癌研究方面，科学家们发现铁死亡有可能成为预测乳腺癌预后的重要指标，还能抑制乳腺癌细胞的生长和扩散。然而，铁死亡在乳腺癌中的触发机制，却如同隐藏在迷雾中的宝藏，等待着研究者们去揭开它的神秘面纱。

紧密连接蛋白 6（CLDN6）属于紧密连接蛋白家族，这个家族就像是细胞之间的 “小卫士”，负责调节细胞间的通透性，还能在细胞间形成屏障。之前的研究已经发现，CLDN6 在乳腺癌中起着肿瘤抑制的作用，不过它的具体机制还不是很清楚。而且，研究人员意外地发现，过表达 CLDN6 会让乳腺癌细胞出现铁死亡的超微结构变化，这让大家猜测，CLDN6 和铁死亡之间是不是有着某种神秘的联系呢？但 CLDN6 到底是如何影响铁死亡的，目前还没有明确的答案。

为了搞清楚这些问题，来自 作者[第一作者单位] 的研究人员展开了深入的探索。他们的研究成果发表在了《Nature Communications》期刊上，论文题目是《CLDN6 triggers NRF2-mediated ferroptosis by recruiting DLG1/PBK complex in breast cancer》。通过一系列实验，研究人员得出了重要结论：他们明确了 CLDN6 和铁死亡联合评估对乳腺癌患者预后的预测意义，还揭示了 CLDN6 通过招募 DLG1/PBK 复合物，触发 NRF2（核因子 E2 相关因子 2）介导的铁死亡这一全新机制。这一发现意义重大，不仅为预测乳腺癌预后提供了可靠的生物标志物，还为针对铁死亡的乳腺癌治疗方案选择提供了重要的指导。

在研究过程中，研究人员用到了几个关键技术方法。免疫组织化学（IHC）技术，就像是给细胞做 “标记”，可以用来检测组织中特定蛋白的表达情况。透射电子显微镜（TEM）则能让研究人员看到细胞的超微结构，了解细胞内部的细微变化。还有，检测细胞内活性氧（ROS）、脂质过氧化、谷胱甘肽（GSH）水平，以及进行免疫荧光（IF）、免疫共沉淀（Co-IP）等实验，这些技术方法从不同角度为研究提供了关键信息。

下面我们来详细看看研究结果。

整合 CLDN6 和铁死亡的预后意义

研究人员发现，CLDN6 在正常乳腺上皮细胞中高表达，可到了乳腺癌细胞里，它的表达量却很低，就像一个原本活跃的 “小战士” 突然变得萎靡不振。通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）发现，与 CLDN6 共表达的基因主要富集在铁死亡、谷胱甘肽代谢和磷酸戊糖途径中。而且，CLDN6 的表达还和铁死亡评分呈正相关。进一步分析发现，CLDN6 低表达的患者，NRF2 表达反而更高。综合这些结果表明，CLDN6 在乳腺癌患者中表达不足，并且和铁死亡密切相关。

接着，研究人员分析了 CLDN6 和铁死亡联合评估对患者预后的影响。他们发现，CLDN6 高表达且铁死亡评分高的患者，预后更好。于是，他们把 CLDN6 表达和铁死亡评分整合起来，创建了 CLDN6 & 铁死亡（C&F）分类器。这个分类器在预测乳腺癌患者预后方面表现非常出色，比单独使用 CLDN6 表达或铁死亡评分更可靠，这说明 CLDN6 和铁死亡联合评估对判断患者预后很有价值。

CLDN6 触发乳腺癌细胞铁死亡

研究人员想知道 CLDN6 对乳腺癌细胞铁死亡到底有什么影响，就用 CCK-8 和集落形成实验检测细胞死亡情况。结果发现，CLDN6 会抑制乳腺癌细胞的活力，减少克隆数量，要是把 CLDN6 沉默掉，这种抑制作用就会减弱。他们还发现，CLDN6 会让乳腺癌细胞对多种铁死亡诱导剂（FINs）更敏感，而且只有铁死亡抑制剂 Fer-1 能逆转这种作用，这就表明 CLDN6 诱导的细胞死亡主要是铁死亡。

从超微结构和生化水平来看，过表达 CLDN6 会让乳腺癌细胞的线粒体体积变小、膜密度增加，细胞内 ROS 和脂质过氧化水平升高，GSH 水平下降，这些都是铁死亡的典型特征，而且 Fer-1 能把这些变化都逆转回来。这一系列实验充分证明，CLDN6 确实可以诱导乳腺癌细胞发生铁死亡。

CLDN6 通过 AKT/GSK3β/FYN 轴促进 NRF2 核输出诱导铁死亡

研究人员进一步分析 C&F 分类器，发现高 CLDN6 表达且高铁死亡评分组和低 CLDN6 表达且低铁死亡评分组之间的差异表达基因，主要富集在紧密连接、铁死亡、脂肪酸生物合成、谷胱甘肽代谢和 NRF2 通路中。这让他们猜测 NRF2 可能是 CLDN6 和铁死亡之间的 “桥梁”。

后续实验发现，CLDN6 不会改变 NRF2 的 mRNA 水平，但会降低 NRF2 及其靶基因（如 GPX4 和 G6PD）的蛋白质水平，还会减少 NRF2 在细胞核中的定位。由于 NRF2 的核输出和输入对其功能很关键，而 CLDN6 又不影响 NRF2 在 Ser40 位点的磷酸化水平和 KEAP1 的表达，所以研究人员推测 CLDN6 是通过促进 NRF2 核输出来抑制其活性的。

研究还发现，CLDN6 会降低 AKT 在 Ser473 残基和 GSK3β 在 Ser9 残基的磷酸化水平，增加细胞核中 FYN 的表达。而 AKT/GSK3β/FYN 轴是调节 NRF2 核输出的重要信号通路，这就意味着 CLDN6 可能是通过这个轴来促进 NRF2 核输出的。最后，研究人员通过过表达 NRF2 发现，NRF2 可以逆转 CLDN6 诱导的铁死亡相关变化，这进一步证实了 CLDN6 是通过 NRF2 诱导铁死亡的。

CLDN6 通过 PBK 调节 AKT/GSK3β/FYN 轴

已知 PBK 能激活 AKT，研究人员发现 CLDN6 虽然不影响 PBK 的 mRNA 水平，但会降低其蛋白质表达。进一步研究发现，CLDN6 会通过泛素 - 蛋白酶体系统（UPS）加速 PBK 的降解。

过表达 PBK 会增加 AKT 和 GSK3β 的磷酸化水平，降低 FYN 的核水平，还会增加 NRF2 及其靶基因的表达，减少细胞对 FINs 的敏感性，降低 ROS 和脂质过氧化水平。而使用 NRF2 抑制剂 ML385 后，CLDN6 和 PBK 对 NRF2 及其靶基因的影响就会减弱。这些结果表明，CLDN6 通过调节 PBK 来调控 AKT/GSK3β/FYN 轴，进而诱导 NRF2 介导的铁死亡。

CLDN6 与 DLG1/PBK 复合物的相互作用需要内体途径

研究发现，CLDN6 和 PBK 会在细胞膜上共定位。内体向细胞膜的运输和循环需要 VPS35（形成逆转录复合物）和 SNX27（通过其 PDZ 结构域分选蛋白质）的参与，而且 PBK 可以通过 PBM 与 SNX27 结合。研究人员发现，CLDN6 会促进 PBK 与 VPS35 阳性逆转录复合物和 SNX27 的共定位，这说明 CLDN6 是通过促进逆转录复合物介导的内体途径，把 PBK 运输到细胞膜上的。

通过免疫共沉淀实验和结构分析发现，PBK 和 CLDN6 有结合亲和力，CLDN6 的 PBM 能和 DLG1 的 PDZ 结构域稳定结合。转染 PBM 缺陷的 CLDN6 后发现，它不再和 DLG1 或 PBK 共定位，也不影响 PBK 的蛋白质水平，无法结合 DLG1 或 PBK，这表明 CLDN6 的 PBM 在招募 DLG1/PBK 复合物中起着不可或缺的作用。

CLDN6 在体内诱导乳腺癌发生铁死亡

为了看看 CLDN6 在体内对铁死亡有没有影响，研究人员建立了裸鼠皮下异种移植模型。结果发现，CLDN6 过表达组的肿瘤体积和重量都比对照组小，索拉非尼（sorafenib）治疗后这种差异更明显。通过透射电镜观察发现，CLDN6 会让肿瘤组织的线粒体膜密度增加、脂质滴增多、线粒体嵴减少，索拉非尼治疗后这些变化更严重，这说明 CLDN6 在体内也能诱导铁死亡。

免疫组化染色和蛋白质免疫印迹实验表明，CLDN6 过表达组和索拉非尼治疗的 CLDN6 过表达组中，NRF2 和 GPX4 的表达比对照组低。免疫荧光染色显示 CLDN6、DLG1 和 PBK 在细胞膜上共定位。这些结果都说明，CLDN6 在体内能诱导铁死亡，还能抑制 NRF2 和 GPX4 的表达。

综合研究结论和讨论部分，这项研究意义非凡。研究人员证实了 CLDN6 和铁死亡联合评估对预测乳腺癌预后的重要性，还揭示了 CLDN6 触发 NRF2 介导的铁死亡这一全新机制。这不仅为乳腺癌预后预测提供了新的生物标志物，还为开发针对铁死亡的乳腺癌治疗方法指明了方向。不过，研究也留下了一些待探索的问题，比如 LNX1 是否参与 CLDN6 促进 PBK 降解的过程，肌动蛋白在 CLDN6 调节内体途径中的具体作用等。未来的研究可以围绕这些问题继续深入探索，说不定能为乳腺癌的治疗带来更多突破，让我们一起期待科学家们的新发现吧！