揭秘颅骨神经：从 3D 时空特征洞悉其在生长衰老及疾病中的关键作用

为解决颅骨神经在出生后生长和衰老过程中的空间分布不明等问题，约翰斯?霍普金斯大学的研究人员对颅骨神经和血管进行 3D 时空特征研究。他们发现神经密度变化等结果，这为理解相关机制提供依据，值得科研读者一读。

　　

在骨骼的世界里，有一群 “神秘嘉宾”—— 外周神经，它们对骨骼的发育和损伤修复起着重要作用。就像建筑工地上的指挥家，指挥着骨骼建设的进程。在小鼠的生长过程中，骨骼会不断地发育、重塑，但随着年龄增长，它们的 “修复魔法” 逐渐失效，这和细胞衰老密切相关。像成骨祖细胞会随着年龄增长减少数量和增殖能力，导致骨骼变得脆弱，容易骨折。除了这些细胞，骨骼微环境中的其他 “成员”，比如巨噬细胞、血管等，也在衰老过程中发生变化，影响着骨骼健康。

不过，外周神经在骨骼衰老过程中的作用一直是个谜。骨骼里不仅有能引发头痛和骨折疼痛的感觉神经，还有交感神经，它们和血管关系密切，在血管的生长和分化中发挥着作用。其中，CD31^{hi} Emcn^{hi} 血管对于骨骼的稳态、发育和损伤修复至关重要，可它和神经信号通路之间的关系却不为人知。

此外，像 Apert 综合征这种以颅骨缝过早闭合为特征的疾病，也让科学家们好奇，它对颅骨内的神经和血管结构会有怎样的影响呢？毕竟之前有研究发现，抑制神经会导致颅骨缝闭合异常和骨骼干细胞增殖失调。可目前对于颅骨神经的 3D 分布、随时间的变化以及和血管的关联，我们了解得还很少。以往的研究方法存在局限，无法对完整骨骼中的 3D 结构进行量化分析，难以全面、准确地揭示颅骨神经的奥秘。

为了揭开这些谜团，来自约翰斯?霍普金斯大学的研究人员在《Nature Reviews Rheumatology》期刊上发表了题为 “3D spatiotemporal characterization of calvarial nerves and vasculature during postnatal growth and aging” 的论文。他们通过研究，发现了许多有趣的现象，得出了一系列重要结论，这对我们理解颅骨神经在维持骨骼健康和衰老过程中的作用有很大帮助，也为研究骨骼损伤后的神经模式变化提供了新的视角。

研究人员为了开展这项研究，用到了几个关键的技术方法。首先是定量光片显微镜（QLSM）技术，它就像一台 “透视神器”，能够对整个小鼠颅骨进行高分辨率的 3D 成像，让研究人员清晰地看到神经和血管的分布。其次，基于机器学习的分割方法也发挥了重要作用。借助 Ilastik? 机器学习软件和 Imaris? 等软件，研究人员可以更准确地对神经结构进行分割和分析，获取大量关于神经分布和相互作用的定量数据。

下面我们来详细看看研究人员都有哪些有趣的发现。

• QLSM 助力颅骨神经 3D 可视化：研究人员利用 QLSM 成功地 “看到” 了 β - 3 微管蛋白 ^{+}（TUBB3^{+}）染色的神经在小鼠顶骨、额骨以及冠状缝和矢状缝中的 3D 分布。他们还发现，使用 2’2 - 硫代二乙醇进行组织透明化且不脱钙的方法，对各个年龄段的小鼠都很有效，能让他们看清颅骨不同层面的神经结构。为了更准确地分析神经结构，研究人员开发了一套基于 Ilastik? 和 Imaris? 软件的流程。通过这个流程，他们不仅能更清晰地观察到神经结构，减少背景噪声，还能得到准确的定量数据。与之前的方法相比，QLSM 可以实现整个小鼠颅骨神经的 3D 可视化，并且能生成类似厚切片的横截面图像，还不会对神经结构造成破坏。
• 颅骨神经密度和空间分布随小鼠寿命变化：研究人员用 TUBB3 标记不同年龄段小鼠的颅骨神经，包括出生后第 0 天（P0）、4 周、12 周、40 周和 80 周的小鼠，分别代表新生儿期、发育期、骨骼成熟期、中年期和老年期。他们发现，从 4 周开始，顶骨区域就出现了网状的神经网络，冠状缝区域的神经似乎起源于缝线或骨边界，然后向额骨和顶骨延伸，而额骨的神经则从附近的缝线发出，呈放射状向中心延伸。经过定量分析，研究人员发现神经体积密度在 P0 到 4 周时增加，4 周到 40 周时没有明显变化，但 80 周时急剧下降。而且，这种趋势在额骨和顶骨上有所不同，额骨的神经密度从 12 周开始就明显下降，这表明额骨的神经可能比顶骨的神经更早出现与年龄相关的损失。研究人员还观察了神经在颅骨不同区域的分布情况，发现只有 80 周的样本中，骨膜和硬脑膜的神经比例有显著差异。在骨膜中，神经密度从 P0 到 4 周增加，40 周前保持稳定，80 周时下降；而硬脑膜中，虽然从 P0 到 4 周神经也增加，但幅度没有骨膜大。在额骨中，只有骨膜的神经密度有显著增加趋势，而且 40 周时骨膜神经密度的下降也表明，早期额骨神经损失主要发生在骨膜。
• 神经与变化的 CD31^{hi} Emcn^{hi} 血管群优先关联：研究人员之前已经对小鼠颅骨中的血管进行过研究，这次他们假设神经可能会优先与 CD31^{hi} Emcn^{hi} 血管关联。为了验证这个假设，他们对不同年龄段的颅骨进行染色观察。结果发现，CD31^{+} 血管在各个年龄段都分布在颅骨各处，直径随年龄增加而增大，体积密度略有下降；Emcn^{+} 血管则随着年龄发生显著形态变化，骨髓中的窦状血管信号增强，Emcn^{hi} 信号几乎消失。总体血管密度没有随年龄变化，但血管表型却有不同的空间模式，CD31^{hi} Emcn^{-} 血管密度和表型分数增加，而 CD31^{hi} Emcn^{hi} 血管密度和表型分数显著下降。研究人员进一步分析神经与血管的空间关系，发现虽然有些神经与较大血管相邻，但大多数神经并不直接沿着血管分布。不过，各个年龄段的神经都优先与 CD31^{hi} Emcn^{hi} 血管在空间上关联，只是这种关联程度会随着年龄增长而降低。
• 小的无髓神经亚型随出生后发育增加，大的有髓神经不受影响：在研究过程中，研究人员发现 TUBB3^{+} 神经在骨骼成熟过程中没有明显变化，但他们知道神经对骨骼发育很重要，所以又研究了感觉标记物神经丝（NeuF）、降钙素基因相关肽（CGRP）和交感标记物酪氨酸羟化酶（TH）在出生后发育和骨骼成熟过程中的变化。结果发现，CGRP^{+} 和 TH^{+} 神经在出生后发育阶段密度增加，而 NeuF^{+} 神经没有变化。这说明有些神经亚型会随着骨骼成熟而扩展、成熟和特化。在骨膜和硬脑膜的分布上，只有 NeuF^{+} 和 TH^{+} 神经在 4 周时优先定位于骨膜，但出生后发育后这种定位就消失了。CGRP^{+} 神经在骨膜和硬脑膜的神经体积密度都增加，而 TH^{+} 神经只在硬脑膜中增加。这些无髓神经的生长在不同区域有不同的表现，CGRP^{+} 神经在各个区域都增加，TH^{+} 神经只在硬脑膜的部分区域增加。而且，这些神经亚型与血管表型的空间关联在出生后发育过程中基本没有变化，都与 CD31^{hi} Emcn^{hi} 血管保持一定关联，只是随年龄略有下降。
• Fgfr2 P253R 突变对神经血管结构影响有限：由于研究人员发现冠状缝区域有大量神经，而且之前有研究表明 TrkA 抑制与缝线融合有关，所以他们想看看像 Apert 综合征这种缝线相关疾病对神经血管分布有没有影响。Apert 综合征小鼠模型中，Fgfr2^{+/P253R} 突变会导致冠状缝在出生前融合。研究人员对 P0 的 Fgfr2^{+/P253R} Apert 综合征小鼠和它们的野生型同窝小鼠的颅骨进行染色和成像。结果发现，从定性上看，两组小鼠的神经血管结构没有明显差异，都有清晰的血管网络和神经分布；从定量上看，神经分布、总体和区域神经体积、骨膜和硬脑膜神经的比例和体积密度等都没有明显变化。同样，血管方面，总体血管体积、血管表型和空间关联也没有受到影响。

综合研究结果和讨论部分，这项研究意义重大。研究人员首次对颅骨神经亚型分布及其与血管表型的关联进行了定量评估，发现了许多新现象。比如，在小鼠出生后发育过程中，CGRP^{+} 和 TH^{+} 神经体积分数随骨骼成熟而增加，这表明神经可能会随着骨骼的成熟而进一步特化，对维持成熟骨骼的结构和代谢平衡有重要作用。而在衰老过程中，颅骨神经密度下降，尤其是额骨比顶骨更早出现神经损失，这可能与年龄相关的骨丢失和骨骼脆性增加有关，但神经在衰老骨骼中的具体作用还需要进一步研究。此外，研究还发现神经优先与 CD31^{hi} Emcn^{hi} 血管在空间上关联，这种关联在衰老过程中虽然减弱但依然存在，说明它们之间的相互作用对骨骼发育和稳态维持非常重要。在 Apert 综合征研究方面，虽然没有发现该疾病对新生儿颅骨神经血管结构有明显影响，但这个研究平台可以用于研究其他颅骨相关疾病，为揭示疾病机制提供帮助。

总的来说，这项研究为我们深入了解颅骨神经和血管在生长、衰老以及疾病状态下的变化提供了丰富的信息，就像为我们打开了一扇通往颅骨微观世界的大门，让我们看到了神经和血管的 “秘密生活”。这些发现有助于进一步阐明颅骨神经在维持骨骼健康和应对疾病中的作用，也为开发促进骨骼愈合的治疗方法提供了理论依据。未来，研究人员可以基于这些成果，进一步探索神经和血管相互作用的机制，以及如何通过调节它们的关系来改善骨骼健康，让我们对骨骼的奥秘有更深入的认识。