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为解决糖尿病足溃疡（DFU）治疗难题，苏州大学第一附属医院的研究人员开展 ANG1 改造间充质干细胞（MSCs）的研究，发现其能促进血管生成和伤口愈合。该研究为 DFU 治疗提供新策略，值得科研读者一读。
在当今社会，糖尿病的患病率如同不断攀升的温度计，一路飙升。其中，2 型糖尿病（T2D）患者数量庞大，目前全球已超 5 亿人。而这庞大群体中，约 20% 的患者会遭遇一个棘手的难题 —— 糖尿病足溃疡（DFU）。DFU 就像一个顽固的 “小怪兽”，由于缺乏明确有效的治愈方案，它会不断 “作恶”，病情严重时可发展为坏死，甚至迫使患者接受截肢手术，给患者带来极大的身心痛苦，同时也让社会医疗负担愈发沉重。
血管功能不足在 DFU 的发病和治疗结果中扮演着极为关键的角色。打个比方，血管就像是身体里的 “交通网络”，而在 DFU 患者体内，这个 “交通网络” 出现了堵塞，导致伤口难以愈合。尽管补充血管生成细胞或生长因子等方法在促进糖尿病伤口血管生成方面取得了一定进展，但它们也面临着诸多挑战。比如，这些补充的物质容易降解，释放难以控制，还存在安全隐患，治疗费用也很高，这些问题就像一道道关卡，限制了它们在临床上的广泛应用。
间充质干细胞（MSCs）凭借其强大的免疫调节和促再生能力，成为了治疗 DFU 的 “潜力股”。它就像一个具有神奇修复能力的 “小精灵”，在治疗多种疾病方面展现出了巨大的潜力。然而，在 DFU 这个特殊的 “战场” 上，由于局部病理条件恶劣，MSCs 的治疗效果大打折扣。那么，如何才能让这个 “小精灵” 发挥出更大的威力呢？研究人员想到了一个办法，那就是对 MSCs 进行基因改造，让它携带特定的治疗分子，比如合适的血管生成因子，以适应 DFU 的特殊病理状况。
苏州大学第一附属医院的研究人员在《Stem Cell Research & Therapy》期刊上发表了一篇名为 “Engineering mesenchymal stem cells with angiopoietin-1 promotes diabetic wound healing by enhancing angiogenesis” 的论文。他们通过一系列研究得出结论：单独使用 MSCs 治疗能够促进血管生成和 DFU 愈合，而用血管生成素 - 1（ANG1）对 MSCs 进行工程改造后，能为这一治疗过程带来更多显著的益处，这为治疗 DFU 开辟了一条充满希望的新途径。
为了开展这项研究，研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：首先是细胞培养技术，他们从脐带中分离培养出 MSCs 和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）；接着利用慢病毒转染技术，构建出稳定表达 ANG1 和绿色荧光蛋白（GFP）的工程化 MSCs（MSC^{ANG1}）；还使用了动物模型构建技术，建立了正常和糖尿病伤口小鼠模型；实验过程中，采用了免疫组化、定量 PCR（q - PCR）和蛋白质免疫印迹（WB）等技术，对相关指标进行检测分析。
下面来看看具体的研究结果。
糖尿病伤口愈合过程中血管生成减少和 ANG1 水平降低
研究人员发现，糖尿病小鼠的伤口愈合速度明显比正常小鼠慢。就好像正常小鼠的伤口在愈合时是在 “快步走”，而糖尿病小鼠的伤口则是在 “慢慢爬”。通过对比，他们观察到在受伤后的 7 天、14 天和 21 天，糖尿病小鼠的伤口面积明显更大。同时，在糖尿病伤口再生组织中，含有 CD34 阳性造血和内皮细胞的血管样结构数量，在 14 天和 28 天时也显著低于正常伤口。这表明糖尿病伤口的血管生成不足，愈合过程延迟。
进一步研究发现，在糖尿病伤口愈合过程中，像成纤维细胞生长因子 2（FGF2）、ANG1、表皮生长因子（EGF）和缺氧诱导因子 - 1（HIF1）等促血管生成因子的表达水平普遍呈下降趋势，而抗血管生成因子如 Sprouty RTK 信号拮抗剂 2（SPRY2）、血小板反应蛋白 1（TSP1）、亲吻素 - 1（KISS1）和 IV 型胶原 a1 链（COL4A1）等的表达水平却有所上升。不过，血管生成过程中这些因子的相互作用十分复杂，有些因子如基质金属蛋白酶 9（MMP9）在糖尿病伤口愈合后期表达上调，而组织金属蛋白酶抑制剂 1（TIMP1）和血小板因子 4（PF4）等抗血管生成因子则表达下调。值得注意的是，ANG1 在整个糖尿病伤口愈合过程中表达持续降低，这表明 ANG1 可能是增强糖尿病伤口血管生成的关键治疗靶点，也是构建工程化 MSCs 的理想候选因子。
可追踪的稳定表达 ANG1 的 MSCs 的构建
研究人员设计并构建了一种携带 ANG1 和 GFP 基因的慢病毒质粒，然后将其转染到 MSCs 中，得到了 MSC^{ANG1}。通过免疫染色检测 GFP 发现，MSC^{ANG1} 中约 80% 的细胞都能强表达 GFP，这就像是给这些细胞贴上了绿色的 “小标签”，方便后续观察。而且，MSC^{ANG1} 和未处理的 MSCs 一样，都表达间充质特异性标记物 CD90 和 CD105，不表达造血标记物 CD34 和白细胞标记物 CD45，并且保留了向成骨和成脂谱系分化的能力。蛋白质免疫印迹分析显示，MSC^{ANG1} 细胞裂解物和条件培养基（CM）中 ANG1 的表达水平大幅增加，这说明 ANG1 成功在 MSC^{ANG1} 中表达并分泌。此外，通过追踪移植的细胞发现，ANG1 的产生并没有影响 MSCs 在体内的存活。
MSC^{ANG1} 促进 HUVECs 的存活、管状形成以及 Akt 激活
考虑到 MSCs 主要通过旁分泌机制发挥治疗作用，研究人员用不同工程化 MSCs 的 CM 处理 HUVECs，来评估 MSC^{ANG1} 对内皮细胞的影响。结果发现，MSC^{GFP} 对 HUVECs 的存活有一定的保护作用，而 MSC^{ANG1} - CM 进一步增强了这种保护效果。这就好比 MSC^{GFP} 给 HUVECs 提供了一把 “小伞”，能遮点 “风雨”，而 MSC^{ANG1} - CM 则给 HUVECs 提供了一把更大更坚固的 “伞”。通过细胞计数和凋亡检测等实验都证实了这一点。同时，MSC^{ANG1} - CM 还显著促进了 HUVECs 形成毛细血管样结构的能力，增强了其血管生成潜力。
进一步研究发现，Akt 通路与内皮细胞的存活和血管生成能力密切相关。蛋白质免疫印迹分析显示，与对照组和 MSC^{GFP} - CM 处理组相比，MSC^{ANG1} - CM 处理的 HUVECs 中，ANG1 的特异性受体 Tie2 的磷酸化和激活增加，Akt 的磷酸化水平也升高，这表明 MSC^{ANG1} 通过 Tie2 显著增强了 Akt 的激活。
MSC^{ANG1} 促进 HUVECs 的功能成熟
ANG1 在血管稳定和结构完整性方面起着关键作用。研究人员通过评估 HUVECs 单层的通透性发现，与对照组和 MSC^{GFP} - CM 处理组相比，用 MSC^{ANG1} - CM 处理的 HUVECs 对荧光染料 Dextran - FITC 的穿透明显减少，这说明 ANG1 有效地减少了内皮屏障的渗漏，促进了血管的完整性。
血管内皮钙粘蛋白（VE - Cadherin）是维持血管完整性的重要成分。研究人员发现，MSC^{ANG1} - CM 处理后，HUVECs 细胞边界处 VE - Cadherin 的表达上调，蛋白质免疫印迹分析也证实了这一点。同时，MSC^{ANG1} - CM 处理还降低了原癌基因酪氨酸蛋白激酶 Src（Src）的磷酸化水平。这一系列结果表明，外源性 ANG1 在 MSCs 中的表达进一步增强了其血管生成能力，促进了内皮细胞的功能成熟。
MSC^{ANG1} 移植促进糖尿病伤口愈合过程中的血管生成
研究人员在移植后 14 天，对不同工程化 MSCs 移植后的糖尿病伤口愈合过程中的血管生成情况进行了评估。通过对血管内皮细胞标记物 CD34 和周细胞标记物 α - SMA 进行双重免疫染色发现，与对照组和 MSC^{GFP} 移植组相比，MSC^{ANG1} 移植的伤口组织中，具有 CD34^{+} 细胞在内层、α - SMA^{+} 细胞在外层的血管样结构显著增加。蛋白质免疫印迹分析也证实了 MSC^{ANG1} 移植的糖尿病伤口再生组织中 CD34 的表达升高。
此外，蛋白质免疫印迹分析还显示，MSC^{ANG1} 移植的糖尿病伤口中，Tie2 受体和下游 Akt 通路显著磷酸化，这表明 ANG1/Tie2/Akt 通路的激活有助于 MSC^{ANG1} 增强糖尿病伤口愈合过程中的血管生成。同时，对 VE - Cadherin 的检测发现，MSC^{ANG1} 处理的伤口中，同时表达 CD34 和 VE - Cadherin 的血管样结构明显增多，VE - Cadherin 的表达升高，Src 的表达降低。这些结果表明，MSC^{ANG1} 通过与 Tie2 受体结合，显著激活 Akt 通路，抑制 Src 活性，从而增强了糖尿病伤口愈合过程中的血管生成，改善了血管的完整性。
MSC^{ANG1} 移植加速糖尿病伤口愈合
研究人员还发现，与对照组和 MSC^{GFP} 移植组相比，MSC^{ANG1} 移植的伤口在 7 天、14 天和 21 天时面积明显更小，这说明工程化的 MSC^{ANG1} 能够显著加速伤口愈合。
上皮恢复是伤口愈合的关键环节。通过苏木精 - 伊红（HE）染色和对上皮标记物 K14 的免疫染色发现，在移植后 14 天，MSC^{ANG1} 移植的糖尿病伤口上皮间隙最窄。到了移植后 28 天，所有伤口都被上皮覆盖，MSC^{GFP} 和 MSC^{ANG1} 移植的伤口真皮厚度显著增加，但两者之间没有显著差异，这表明 MSC^{ANG1} 治疗不会诱导真皮成纤维细胞过度增殖。
血管生成在皮肤附属器的功能再生中起着重要作用。通过对 K14 和再生毛囊标记物 K17 进行双重免疫染色发现，在移植后 14 天和 28 天，MSC^{ANG1} 移植的糖尿病伤口过渡区中，K14 和 K17 共定位的毛囊数量明显增多。这些结果表明，MSC^{ANG1} 通过促进表皮和真皮的重建，以及皮肤附属器的再生，加速了糖尿病伤口的愈合。
综合以上研究，研究人员得出结论：在糖尿病伤口愈合过程中，ANG1 信号存在明显缺陷。而用 ANG1 对 MSCs 进行工程改造后得到的 MSC^{ANG1}，对内皮细胞的存活、迁移和功能性紧密连接的形成有显著影响。MSC^{ANG1} 能够促进糖尿病伤口愈合过程中的血管生成，增强血管完整性，其机制主要是激活 Akt 通路和抑制 Src 活性。伴随着血管生成的增加，MSC^{ANG1} 处理的糖尿病伤口在表皮和真皮重建以及毛囊再生方面都明显加快。这一研究成果意义重大，为 DFU 的治疗提供了一种全新的、更有效的策略，有望为众多糖尿病患者带来新的希望，让他们能够摆脱 DFU 的困扰，走向健康生活。同时，也为后续相关领域的研究指明了方向，激励更多科研人员探索更好的治疗方法，为人类健康事业贡献力量。
