揭秘糖尿病伤口难愈之谜：NETs 与 PI3K/Rac1 通路的 “纠葛” 及潜在疗法

为解决糖尿病伤口愈合困难的问题，解放军总医院的研究人员开展了关于 NETs 对糖尿病伤口愈合影响的研究。结果发现 NETs 经 PI3K/Rac1 通路影响巨噬细胞吞噬功能，阻碍伤口愈合。该研究为治疗提供新策略，值得科研读者一读。

　　

在当今社会，随着生活水平的提高，糖尿病这个 “健康杀手” 的发病率也在不断攀升。糖尿病就像一个隐藏在身体里的 “捣蛋鬼”，会引发各种各样的并发症，其中皮肤伤口愈合困难就是一个让人头疼不已的问题。想象一下，对于糖尿病患者来说，一个小小的伤口可能就像一个难以填平的 “大坑”，迟迟无法愈合，甚至还可能导致严重的后果，比如糖尿病足溃疡，严重时甚至需要截肢，这给患者的生活带来了极大的痛苦。

为什么糖尿病患者的伤口这么难愈合呢？原来，在糖尿病患者的伤口局部环境中，有很多复杂的变化。一方面，会产生大量的凋亡细胞（Apoptotic Cells，ACs） ，这些细胞就像是战场上的 “残骸”，如果不能及时清理，就会影响伤口的恢复。而巨噬细胞（Macrophage）的吞噬作用就像是战场上的 “清洁队”，负责清除这些凋亡细胞，对伤口的愈合起着至关重要的作用。然而，糖尿病患者的巨噬细胞 “清洁队” 却好像出了点问题，它们的吞噬能力下降，导致凋亡细胞在伤口处堆积，形成了一个不利于伤口愈合的 “垃圾场”。

另一方面，中性粒细胞（Neutrophil）在伤口愈合的早期也扮演着重要角色。它们会释放出中性粒细胞胞外陷阱（Neutrophil Extracellular Traps，NETs），这东西就像一张 “大网”，可以捕捉和消灭微生物，保护身体免受感染。但在糖尿病患者体内，这张 “大网” 似乎有点失控了，过多的 NETs 不仅会对组织造成损伤，还可能影响巨噬细胞的正常功能。

到这里，问题就来了：这三者之间到底有着怎样的联系呢？NETs 是不是就是导致巨噬细胞吞噬能力下降，进而影响糖尿病伤口愈合的 “罪魁祸首” 呢？如果是，它又是通过什么机制来影响的呢？为了弄清楚这些问题，解放军总医院的研究人员展开了深入的探索，并在《Cell Communication and Signaling》期刊上发表了题为 “Neutrophil extracellular traps impair macrophage efferocytosis via the PI3K/Rac1 pathway in diabetic wounds” 的论文 。研究发现，NETs 通过 PI3K/Rac1 信号通路影响巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬作用，进而阻碍糖尿病伤口的愈合。这一发现为治疗糖尿病伤口愈合困难提供了新的潜在治疗策略，就像在黑暗中为糖尿病患者的伤口愈合找到了一盏 “希望之灯”。

为了开展这项研究，研究人员运用了多种关键技术方法。他们首先建立了糖尿病小鼠模型，通过给小鼠注射链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）让小鼠患上糖尿病，以此来模拟糖尿病患者的身体状况。接着，对小鼠进行伤口建模，在小鼠背上制造出标准的全层切除伤口，方便观察伤口的愈合过程。然后，利用细胞培养技术，培养了小鼠巨噬细胞系 Raw264.7 细胞以及分离了小鼠骨髓来源的中性粒细胞等。此外，还采用了免疫荧光染色、蛋白质免疫印迹（Western blot）、流式细胞术等技术，来检测各种细胞指标和信号通路的变化情况 。

下面我们来看看具体的研究结果。

NETs 在体内外均损害巨噬细胞的吞噬作用

研究人员通过免疫荧光染色发现，与正常小鼠相比，糖尿病小鼠伤口处的 NETs 水平明显升高，就像糖尿病小鼠的伤口里 “撒” 了更多的 “大网”。同时，糖尿病小鼠伤口处巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬能力却下降了，“清洁队” 的工作效率变低了。为了进一步探究其中的关系，研究人员使用了一种叫做 Cl-Ad 的药物来抑制 NETs 的形成。结果发现，抑制 NETs 后，糖尿病小鼠伤口处巨噬细胞的吞噬能力恢复了，伤口里的 “垃圾” 被清理得更快了，伤口愈合也加速了。在体外实验中，用 NETs 处理 Raw264.7 巨噬细胞后，发现这些巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬能力也受到了损害，不过这种损害同样可以被 Cl-Ad 逆转。这一系列实验表明，糖尿病小鼠伤口中的 NETs 会导致巨噬细胞的吞噬功能受损。

NETs 对糖尿病小鼠巨噬细胞的吞噬作用有持续影响

研究人员从糖尿病小鼠和正常小鼠的伤口部位分离出巨噬细胞进行研究。结果发现，与正常伤口来源的巨噬细胞相比，糖尿病伤口来源的巨噬细胞吞噬能力明显受损。为了进一步验证，研究人员还进行了巨噬细胞的过继转移实验，他们先把小鼠体内的巨噬细胞 “清空”，然后分别给它们注射来自正常伤口和糖尿病伤口的巨噬细胞。结果发现，接受糖尿病伤口巨噬细胞的小鼠，伤口愈合更慢，巨噬细胞的吞噬能力也更差。这说明 NETs 对糖尿病小鼠巨噬细胞吞噬能力的影响是持续存在的。

NETs 在体外通过抑制 Rac1 的激活损害巨噬细胞的吞噬作用

在细胞的吞噬过程中，Rac1 就像是一个 “开关”，起着重要的调控作用。研究人员发现，当巨噬细胞与凋亡细胞一起培养时，Rac1 的激活水平会显著升高。但当加入 NETs 后，Rac1 的激活水平就下降了。研究人员还使用了 Rac1 的抑制剂 NSC23766 和激活剂 ML-099 进行实验。结果发现，抑制 Rac1 会损害巨噬细胞的吞噬能力，而激活 Rac1 则可以恢复被 NETs 抑制的吞噬能力。此外，研究人员还构建了过表达 Rac1 的巨噬细胞，发现过表达 Rac1 的巨噬细胞吞噬能力增强。这些实验表明，NETs 通过抑制 Rac1 的激活来降低巨噬细胞的吞噬作用。

NETs 通过抑制糖尿病伤口巨噬细胞中 Rac1 的激活损害吞噬作用

在正常伤口愈合过程中，研究人员发现用 NSC23766 抑制 Rac1 后，伤口来源的巨噬细胞中 Rac1 的激活水平下降，巨噬细胞的吞噬能力也降低了，伤口愈合也变慢了。在糖尿病伤口的研究中，研究人员用 Cl-Ad 抑制 NETs 的形成后，发现糖尿病伤口巨噬细胞中 Rac1 的激活水平恢复了。同时，给糖尿病小鼠伤口注射 Rac1 激活剂 ML-099 后，巨噬细胞的吞噬能力增强，伤口愈合加快。这进一步证实了 NETs 通过抑制巨噬细胞中 Rac1 的激活，损害了糖尿病伤口处巨噬细胞的吞噬作用，从而延缓了伤口愈合。

NETs 在体外通过 PI3K/Rac1 信号通路影响巨噬细胞的吞噬作用

之前的研究表明，PI3K 在吞噬体形成过程中起着关键作用。研究人员在 Raw264.7 巨噬细胞的实验中发现，当巨噬细胞与凋亡细胞一起培养时，PI3K 的磷酸化水平会显著增强，这说明 PI3K 可能参与了巨噬细胞的吞噬过程。研究人员用 PI3K 的抑制剂渥曼青霉素（wortmannin）处理巨噬细胞后，发现 Rac1 的激活水平下降，巨噬细胞的吞噬能力也降低了。这表明 Rac1 是 PI3K 的下游靶点，PI3K 和 Rac1 的协同作用对吞噬过程至关重要。在研究 NETs 对吞噬作用的影响时，研究人员发现，NETs 处理组中 PI3K 和 Rac1 的激活水平都降低了。而用 740Y-P 激活 PI3K 后，可以恢复 Rac1 的激活水平和巨噬细胞的吞噬能力。这些实验表明，NETs 在体外通过 PI3K/Rac1 信号通路调节巨噬细胞的吞噬作用。

NETs 在糖尿病小鼠伤口中通过 PI3K/Rac1 信号通路影响巨噬细胞的吞噬作用

在小鼠伤口实验中，研究人员通过腹腔注射渥曼青霉素抑制 PI3K 的活性，结果发现伤口巨噬细胞中 PI3K 和 Rac1 的激活水平都下降了，巨噬细胞的吞噬能力降低，伤口愈合也变慢了。在糖尿病小鼠伤口的研究中，研究人员发现糖尿病伤口巨噬细胞中 PI3K 的磷酸化水平比正常伤口巨噬细胞低。用 NETs 抑制剂 Cl-Ad 处理后，PI3K 的磷酸化水平恢复了。用 740Y-P 或 ML-099 分别激活 PI3K 或 Rac1 后，糖尿病小鼠伤口巨噬细胞的 PI3K/Rac1 信号通路被激活，巨噬细胞的吞噬能力恢复，凋亡细胞的面积减小，伤口愈合加快。这一系列实验表明，糖尿病小鼠伤口中的 NETs 通过 PI3K/Rac1 信号通路影响巨噬细胞的吞噬作用，进而导致伤口愈合延迟。

综合研究结果和讨论部分来看，这项研究意义重大。它首次揭示了糖尿病小鼠伤口中过多的 NETs 会持续损害巨噬细胞的吞噬作用，导致凋亡细胞堆积，不利于炎症的消退和伤口的正常愈合。并且发现 NETs 是通过调节巨噬细胞的 PI3K/Rac1 信号通路来抑制吞噬作用的。抑制 NETs 的形成或激活 PI3K/Rac1 信号通路都可以恢复巨噬细胞的吞噬能力。这一发现为糖尿病伤口愈合困难的治疗提供了新的潜在靶点，为开发更有效的治疗方法带来了希望。不过，研究也存在一些局限性，比如实验用的是 STZ 诱导的 1 型糖尿病模型，不能完全模拟临床中 2 型糖尿病伤口的复杂情况；伤口愈合涉及多种细胞，而研究仅聚焦于巨噬细胞；研究中使用的抑制剂和激活剂可能存在非特异性影响，且缺乏对具体作用机制的深入研究等 。但这些不足也为后续研究指明了方向，相信在未来，随着研究的不断深入，糖尿病患者伤口愈合困难的问题有望得到更好的解决，为糖尿病患者带来更多的福音。