探秘 cfDNA 甲基化：解锁衰老与肌萎缩侧索硬化症的分子密码，开启神经退行性疾病诊疗新篇

为解决 ALS 诊断难题，印第安纳大学医学院等机构研究人员开展 cfDNA 甲基化在衰老和 ALS 中作用的研究。结果发现其可评估相关变化和分子失调。推荐阅读，助您了解神经退行性疾病潜在生物标志物研究新进展。

　　

在医学领域，神经退行性疾病（Neurodegenerative diseases，NDD）一直是困扰科学家们的难题。这类疾病以神经元功能的逐渐丧失为特征，就像身体里的 “小恶魔”，会引发如运动障碍、认知衰退等一系列症状。肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic lateral sclerosis，ALS）就是其中一种罕见且严重的神经退行性疾病，它主要攻击大脑和脊髓中的运动神经元。想象一下，运动神经元就像是身体运动的 “指挥官”，一旦它们受到侵害，肌肉会逐渐失去力量，患者会慢慢陷入瘫痪，甚至连呼吸都会变得困难，而认知功能通常在疾病后期才会受到影响。

目前，ALS 的诊断面临着重重挑战。大约 5 - 10% 的 ALS 病例是家族性的（Familial ALS，FALS），与基因突变有关，比如 C9ORF72 基因中的六核苷酸重复扩增。但大部分病例是散发性的（Sporadic ALS，SALS），病因复杂，涉及多基因和多种因素。而且，ALS 患者在发病初期症状并不明显，很容易与其他疾病混淆，这就导致了诊断的延迟。等到神经元和运动功能受损变得复杂时，区分不同的 ALS 表型更是难上加难。更让人头疼的是，目前还没有能够确诊 ALS 的可靠生物标志物和血液检测方法，在神经元受到严重损伤之前，很难发现疾病的踪迹。虽然通过腰椎穿刺进行脑脊液（Cerebrospinal fluid，CSF）分析有助于早期检测，但这种方法不仅会让患者感到不舒服，还存在一定的风险。

有没有一种既方便又准确的诊断方法呢？科学家们把目光投向了细胞游离 DNA（Cell-free DNA，cfDNA）。cfDNA 是细胞死亡后释放到血液中的短核酸片段，通常只有 160 - 180bp。它就像是身体的 “小信使”，虽然大部分来自血细胞，但在循环中也能检测到来自受影响组织或细胞类型的疾病相关片段。目前，cfDNA 在癌症早期检测、胎儿遗传异常鉴定、产前诊断、传染病筛查和器官移植评估等领域都展现出了巨大的潜力，可在神经退行性疾病方面，它的潜力还没有得到充分挖掘。

为了探索 cfDNA 在神经退行性疾病中的奥秘，印第安纳大学医学院等机构的研究人员在《Cell Death & Disease》期刊上发表了题为 “Cell-free DNA methylation signatures in aging and amyotrophic lateral sclerosis” 的论文。他们发现，cfDNA 甲基化可以作为评估年龄相关变化和 ALS 特异性分子失调的有力工具，这一发现为神经退行性疾病生物标志物的发现带来了新的希望。

研究人员在这项研究中用到了几个关键技术方法。首先是全基因组亚硫酸氢盐测序（Whole-genome bisulfite sequencing，WGBS），它可以对 cfDNA 的甲基化特征进行分析。其次是利用特定的算法来识别差异甲基化位点（Differentially methylated loci，DMLs）和差异甲基化区域（Differentially methylated regions，DMRs） 。最后，通过血浆 DNA 甲基化反卷积分析来确定不同组织和细胞类型对 cfDNA 的贡献比例。

下面来看看具体的研究结果。

1. cfDNA 中与年龄相关的甲基化特征：研究人员总共招募了 30 名参与者，通过 WGBS 技术对他们的 cfDNA 进行分析，平均每个样本可获得 2410 万个 CpG 位点的数据。他们比较了 5 名年轻人（16 - 23 岁）和 7 名中年人（36 - 63 岁）的 cfDNA 样本，发现年轻人组的全基因组 CpG 甲基化水平平均为 82.9%，中年组为 82.2%。进一步分析发现，两个年龄组之间存在 5223 个差异甲基化位点（DMLs），其中 51.6% 的位点在老年人中甲基化水平降低。这些 DMLs 大多位于基因间区和内含子区域，约 8% 位于调控区域。对这些与年龄相关的 CpG 进行注释和通路分析后发现，它们与肌肉细胞的细胞骨架组织、轴突导向和钙信号通路等有关。研究人员还将自己发现的 DMLs 与大规模表观基因组关联研究（Epigenome-wide association study，EWAS）中发现的年龄相关 CpG 位点进行比较，发现两者存在显著重叠，这表明 cfDNA 能够捕捉到年龄相关的表观遗传变化。
2. ALS 患者 cfDNA 衍生的 DNA 甲基化图谱特征：研究人员对 10 名 ALS 患者和 8 名健康个体的 cfDNA 甲基化图谱进行了研究。结果显示，ALS 患者和健康个体的全基因组 CpG 甲基化水平相似，平均都为 83%。但通过分析，他们发现了 1045 个在 ALS 患者和对照组之间存在差异的甲基化区域（DMRs），这些 DMRs 大小不一，从 51 到 2955 个碱基对不等。其中，低甲基化的 DMRs（564 个）略多于高甲基化的（481 个），并且它们在所有染色体上均有分布。对这些 DMRs 进行基因组注释发现，它们位于基因体、启动子和远端基因间区域，约 21% 位于 CpG 岛。进一步的功能富集分析表明，这些 DMRs 相关基因与细胞 - 细胞粘附过程和内吞作用途径显著相关。此外，研究人员还发现年龄相关的 CpG 与 ALS 相关的 DMRs 存在重叠，这暗示了年龄相关的表观遗传修饰可能与 ALS 的病理生理过程存在交集。
3. ALS 患者 cfDNA 甲基化与脊髓基因表达的相关性：DNA 甲基化在中枢神经系统（Central nervous system，CNS）中以组织和细胞特异性的方式调节基因表达。为了探究 cfDNA 甲基化与 ALS 患者脊髓基因表达的关系，研究人员将 ALS 相关的 DMRs 与脊髓的批量基因表达数据进行整合分析。结果发现，与 DMRs 相关的基因中，有 31 - 33% 在 ALS 患者与对照组的三个脊髓节段（颈段、腰段和胸段）中表现出差异表达。KEGG 通路分析显示，这些重叠基因参与了内吞作用、紧密连接和黏着连接等通路。研究人员还发现，有 31 个差异甲基化基因与 ALS 的疾病进展相关，其中 ARRB2 和 CYBA 在两个脊髓区域都与疾病持续时间相关。这两个基因的 DMRs 在 ALS 患者中呈高甲基化状态，且它们的表达水平在疾病进展过程中下降，这表明它们可能是追踪 ALS 进展的潜在分子标记。
4. cfDNA 中的表观遗传足迹反映 ALS 中细胞特异性基因调控：研究人员利用来自 C9orf72 ALS 患者额叶和运动皮层的单细胞核 RNA 测序（Single-nucleus RNA sequencing，snRNA-Seq）数据，探究 ALS 相关的 DMRs 是否能反映 ALS 患者大脑中细胞水平的基因调控变化。结果发现，在额叶皮层的六种主要细胞类型中，有 260 个（31.5%）DMR 相关基因表达失调；在运动皮层中，有 203 个（24.6%）基因表达失调。其中，兴奋性神经元和星形胶质细胞中失调的基因数量最多，这两种细胞在 ALS 发病机制中起着关键作用。不同细胞类型中，DMRs 主要位于内含子和启动子区域，且大部分 DMR 相关基因以细胞特异性的方式表达失调。此外，额叶皮层和运动皮层中差异表达基因（Differentially expressed genes，DEGs）的功能富集分析结果不同，这表明 ALS 相关的 cfDNA 甲基化变化与大脑区域和细胞类型特异性的基因调控机制有关。
5. 基于 cfDNA 甲基化估计组织 / 细胞来源比例：cfDNA 片段携带的表观遗传足迹可以反映其组织和细胞来源。研究人员通过反卷积算法分析发现，白细胞（包括中性粒细胞和淋巴细胞）是血浆 DNA 的主要来源，这与之前的研究结果一致。但在 ALS 患者中，T 细胞和 B 细胞来源的 cfDNA 比例显著降低，这可能意味着 ALS 患者的免疫细胞动态发生了改变。同时，研究还检测到来自肝脏、肺、心脏和脂肪组织等非血液组织的 cfDNA，且 ALS 患者肝脏来源的 cfDNA 比例增加，这可能暗示 ALS 患者肝脏细胞的死亡速率升高。

研究人员通过对 cfDNA 甲基化的研究，揭示了其在衰老和 ALS 中的重要作用。cfDNA 甲基化不仅能反映年龄相关的表观遗传变化，还能为 ALS 的发病机制提供线索，其相关的 DMRs 和基因可能成为 ALS 诊断和治疗的潜在生物标志物和靶点。此外，通过分析 cfDNA 的组织来源比例，还发现了 ALS 患者免疫细胞和肝脏的异常变化。不过，该研究也存在一定的局限性，比如所有 ALS 患者均为男性，这可能会影响研究结果的普遍性。未来的研究需要纳入更多女性患者，进一步探索 cfDNA 甲基化在 ALS 中的作用，以及其作为非侵入性生物标志物在临床中的应用，如监测疾病进展、早期检测和评估治疗反应等，为攻克 ALS 等神经退行性疾病带来新的曙光。