揭秘肺泡巨噬细胞：VeDTR 小鼠技术解锁呼吸道感染防御新奥秘

为解决 AMs 在呼吸感染中作用研究方法的缺陷及明确其在 GM-CSF 抗 NTM 疗法中的作用，大阪大学研究人员开展相关研究。他们用 VeDTR 技术生成小鼠模型，发现 AMs 作用及与 GM-CSF 的关联。推荐阅读，助力了解呼吸感染机制及治疗策略123。

　　

在人体的肺部，有一种细胞如同忠诚的卫士，时刻守护着呼吸道的健康，它就是肺泡巨噬细胞（Alveolar macrophages，AMs）。AMs 是肺部的 “原住民”，由卵黄囊衍生的前体在粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子（GM - CSF）的影响下成熟并自我更新。它们身兼数职，不仅要清理气道中的共生细菌和异物，还要清除肺泡上皮细胞分泌的多余表面活性剂，防止肺泡塌陷。要是 AMs “罢工”，肺泡表面活性剂就会堆积，引发肺部疾病，比如肺泡蛋白沉积症。

不过，当呼吸道受到病原体侵袭时，AMs 的表现却让人捉摸不透。在面对结核分枝杆菌等病原体时，AMs 到底是助力感染扩散，还是抑制感染，科学界一直争论不休。这主要是因为研究 AMs 功能的方法存在缺陷。传统的化学方法，比如使用氯膦酸盐脂质体，它虽然能诱导巨噬细胞凋亡，但缺乏细胞选择性，会 “误伤” 中性粒细胞等其他细胞，导致研究结果不准确。而基因方法，像使用基因敲除小鼠或表达白喉毒素受体（DTR）的小鼠，也有弊端。基因敲除小鼠不仅会缺失 AMs，还会影响一些树突状细胞，并且随着时间推移会患上肺泡蛋白沉积症，改变肺部环境，干扰研究结果；表达 DTR 的小鼠在使用白喉毒素（DT）处理时，虽然能及时清除 AMs，但其他髓细胞也会被一并消灭。

同时，非结核分枝杆菌中的脓肿分枝杆菌（Mycobacterium abscessus，M. abs）日益成为一个棘手的问题。它生长迅速，还携带耐药基因 erm (41)，对大环内酯类抗生素耐药，治疗起来相当困难。据相关指南显示，大约一半的 M. abs 感染病例在接受标准治疗 12 个月后仍无效果。GM - CSF 吸入疗法作为一种潜在的治疗手段，虽然在临床案例中显示出对难治性非结核分枝杆菌感染有一定疗效，但它与 AMs 之间的关系却不为人知。

为了深入了解 AMs 在呼吸道感染中的真正作用，以及 GM - CSF 吸入疗法与 AMs 的关联，大阪大学的研究人员 Yuki Nakayama、Miwa Sasai 等人在《iScience》期刊上发表了题为 “Targeted labeling and depletion of alveolar macrophages using VeDTR mouse technology” 的论文。研究人员利用 VeDTR 小鼠技术，成功创建了一种能特异性标记和清除 AMs 的小鼠模型，揭开了 AMs 在呼吸道感染中的神秘面纱。

研究人员主要采用了以下几种关键技术方法：一是基因编辑技术，构建特定基因修饰的小鼠模型，如 Chil3 - Flp 小鼠；二是流式细胞术，用于分析细胞的表型和数量变化；三是 RNA 测序技术，筛选和鉴定差异表达基因，确定用于靶向 AMs 的基因。

下面来看看具体的研究结果：

• AM 特异性 YFP 表达：在 VeDTR 小鼠系统中，研究人员挑选 Cx3cr1 作为第一个靶向基因，因为 Cx3cr1 - Cre 小鼠常用于标记各种组织巨噬细胞，包括 AMs。但在 Cx3cr1 - Cre/VeDTR (DFRT) 小鼠中，YFP 不仅在 AMs 中表达，还在其他髓细胞中出现。于是，研究人员通过批量 RNA 测序，对比 YFP? AMs 和其他 YFP?细胞的基因表达谱，从 15 个候选基因中选定 Chil3 作为第二个基因。Chil3 编码的 Ym1 蛋白主要由体外诱导的 M2 巨噬细胞产生，在 YFP? AMs 中表达量极高。通过基因编辑技术构建 Chil3 - Flp 小鼠后，研究人员得到了 Cx3Cr1 - Cre/Chil3 - Flp/VeDTR (LF) 小鼠（CCD 小鼠）。在 CCD 小鼠中，YFP 和 DTR 仅在同时表达 Cx3Cr1 和 Chil3 的细胞中表达，经流式细胞术分析发现，YFP 特异性地标记了 AMs，而在其他肺髓细胞、组织驻留巨噬细胞和外周血单核细胞中均未检测到 YFP 阳性细胞12。
• 条件性 AM 耗竭：CCD 小鼠的 AMs 表达 YFP 和 DTR，研究人员尝试通过注射 DT 来清除 AMs。结果发现，单次腹腔注射 DT 后，AMs 会随着时间逐渐减少，3 天后约 97% 的 AMs 被清除，且这种清除具有 AM 特异性，其他免疫细胞数量不受影响。停止注射 DT 后，AMs 在 21 天左右开始恢复，且恢复的 AMs 仍表达 YFP。此外，短暂清除 AMs 不会像 GM - CSF 缺陷小鼠那样引发肺泡蛋白沉积症。不过，持续注射 DT 2 周会导致 CD11b?单核细胞 / 巨噬细胞数量略有增加3。
• AMs 对急性 M. abs 感染的影响：研究人员发现，表达 mCherry 的 M. abs 能高度选择性地感染 CCD 小鼠的 AMs。通过对比 DT 处理和 PBS 处理的 CCD 小鼠肺部 M. abs 载量，研究人员发现，感染初期，AMs 可短暂抑制 M. abs 在肺部的增殖；但到了感染后期，无论是否存在 AMs，细菌载量都有所下降且水平相当4。
• IFN - γ 对 AM 消失及 M. abs 感染的影响：研究人员发现，在 M. abs 感染过程中，野生型小鼠肺部的 AMs 会在第 7 天消失，而 IFN - γ 受体缺陷小鼠（Ifngr1?/?小鼠）中 AMs 的消失现象则不那么明显，这表明 IFN - γ 参与了 M. abs 感染诱导的 AMs 消失过程。为了探究 IFN - γ 诱导的 AMs 消失是否有助于抵抗 M. abs 感染，研究人员对 CCD 小鼠进行了一系列处理。结果发现，IFN - γ 诱导的 AMs 消失可能抑制 M. abs 增殖，但除了 AMs 消失之外，IFN - γ 还通过其他机制来抵御 M. abs 感染56。
• AMs 在 GM - CSF 介导的抗 M. abs 感染中的作用：研究人员建立了 GM - CSF 吸入治疗 M. abs 感染的小鼠模型，发现鼻内吸入重组 GM - CSF 蛋白可有效降低肺部 M. abs 数量。GM - CSF 处理后，AMs 表面的 CD11b 水平增加，CD11b? AMs 数量增多，但总 AMs 数量不变。在 CCD 小鼠中，预先用 DT 清除 AMs 后再给予 GM - CSF，发现 DT 处理组肺部 M. abs 载量显著高于 PBS 处理组，这表明 AMs 是 GM - CSF 吸入介导的抗 M. abs 感染的关键因素78。

综合研究结果和讨论部分，这项研究意义重大。研究人员成功构建的 CCD 小鼠模型，为研究 AMs 在呼吸道感染中的作用提供了有力工具。通过这个模型，研究人员发现 AMs 在抑制 M. abs 和 SARS - CoV - 2 增殖方面发挥着重要作用，但对肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae，Spn）的作用却相反，这与以往使用氯膦酸盐脂质体的研究结果不同，凸显了研究方法的重要性。同时，研究还揭示了 IFN - γ 依赖的 AMs 消失有助于减少肺部 M. abs 载量，以及 AMs 是 GM - CSF 吸入疗法对抗 M. abs 感染的关键。这不仅为理解呼吸道感染的发病机制提供了新视角，也为开发针对难治性非结核分枝杆菌感染的治疗策略提供了理论依据，有望推动肺部疾病治疗领域的发展。不过，研究也存在一些局限性，比如 CCD 小鼠模型在其他疾病模型中的细胞特异性有待验证，DT 诱导的 AMs 耗竭难以长期维持，AMs 抑制感染的精确机制还不清楚等。未来，还需要进一步深入研究来解决这些问题，让我们对肺部免疫防御机制有更全面、更深入的认识。