dnd1 和 nanos3 携手，解锁青鳉生殖细胞诱导奥秘，开启基因编辑新篇章

为明确硬骨鱼类 PGC 形成所需最小基因集，北海道大学的研究人员开展 dnd1 和 nanos3 对青鳉 PGC 形成影响的研究。结果发现二者协同诱导 iPGCs，还能增强基因整合。推荐阅读，助您了解生殖细胞发育及基因编辑新进展。

　　

在奇妙的生命科学领域，生殖细胞的发育一直是科学家们热衷探索的神秘地带。原始生殖细胞（PGCs）作为卵子和精子的前体，肩负着将遗传物质传递给下一代的重任，其发育机制的研究意义非凡。动物体内 PGC 的形成主要有两种模式：一种是 epigenesis，在这种模式下，生殖细胞的命运由其他组织的诱导信号决定，就像哺乳动物中，已经明确了足以促使 PGC 形成的诱导信号，这也为从胚胎干细胞和诱导多能干细胞中诱导 PGC 的技术奠定了基础；另一种是 preformation，细胞通过继承卵子中积累的生殖细胞命运决定因子或生殖质（GP）从而成为 PGC。

在硬骨鱼类中，虽然已经发现了不少 GP 的组成基因，比如 vasa、piwi、tdrd、dazl、dead end1（dnd1）、nanos3 和 bucky ball（buc）等，但对于 PGC 形成所必需的最小基因集，科学家们还知之甚少。此前有研究尝试通过过表达 GP 基因，从鱼类胚胎的卵裂球中诱导 PGC。在斑马鱼和青鳉中，过表达 buc 基因会使生殖细胞数量增加；在青鳉中，过表达 dnd1 基因也能达到类似效果。不过，单独过表达单个 GP 组件似乎只能从部分卵裂球中诱导出 PGC，这表明 PGC 的形成或许还需要其他组件的参与。最近，有研究发现九个 GP 组件能有效地从斑马鱼卵裂球中诱导出类似 PGC 的细胞（iPGCs），但这些因素是否都不可或缺，还是仅少数关键因素就足够，仍然是未解之谜。

青鳉，作为一种非常适合遗传分析和胚胎操作的实验模式鱼，其 Y 染色体上性别决定基因 DMY/dmrt1by 的发现，让它在生殖生物学研究，如性腺性别分化和生殖细胞发育等方面，展现出独特的优势。为了揭开 PGC 形成所需最小 GP 组件的神秘面纱，北海道大学的 Toshiya Nishimura 和 Takafumi Fujimoto 在《iScience》期刊上发表了题为 “Generation of primordial germ cell - like cells by two germ plasm components, dnd1 and nanos3, in medaka (Oryzias latipes)” 的论文。他们发现，dnd1 和 nanos3 这两个 GP 组件能够协同作用，从青鳉胚胎的卵裂球中诱导出 iPGCs，并且这些 iPGCs 能够发育成功能性的卵子和精子，同时，利用 iPGC 诱导技术还能增强 CRISPR - Cas9 介导的基因整合，实现精确的内源性蛋白质标记。这一研究成果不仅为我们理解生殖细胞的发育机制提供了新的视角，还在基因编辑工具开发等生物技术应用方面展现出巨大的潜力。

为了开展这项研究，研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：首先是 CRISPR - Cas13d 系统，利用它对相关基因进行敲低，以此来探究基因在生殖细胞形成过程中的作用；其次是基因过表达技术，通过向胚胎中注入特定基因的 mRNA，实现基因的过表达，观察其对 iPGC 形成的影响；此外，还运用了细胞移植技术，将过表达相关基因的卵裂球移植到宿主胚胎中，研究 iPGC 的发育和功能；最后，利用免疫组织化学染色和原位杂交等技术，对基因的表达和细胞的特性进行检测和分析。

下面我们来详细看看研究人员都取得了哪些成果。

敲低 dnd1 和 nanos3 可诱导生殖细胞缺陷的青鳉

研究人员运用 CRISPR - Cas13d 系统，对一系列 GP 和生殖细胞相关基因进行了敲低筛选。他们精心挑选了 30 个在脊椎动物中保守的生殖系相关基因，并为每个基因设计了 3 个 gRNAs。令人惊讶的是，仅仅敲低 dnd1 和 nanos3 这两个基因，就几乎导致青鳉胚胎中 100% 的生殖细胞缺失。这一结果暗示，dnd1 和 nanos3 在青鳉生殖细胞的形成过程中，可能起着至关重要的作用。

dnd1 和 nanos3 足以在青鳉中诱导 PGC 样细胞

为了进一步探究 dnd1 和 nanos3 对生殖系形成的作用，研究人员在青鳉胚胎中过表达这两个基因。他们巧妙地将 nanos3 和 dnd1 的 3'UTR 替换为 SV40pA，以此来稳定 mRNA 的表达。结果发现，过表达 dnd1 和 nanos3 的胚胎（DN - OE）在囊胚期时，mCherry 信号在整个卵裂球中上调，并且胚胎在原肠胚形成之前就停止了发育。研究人员还进行了移植实验，将 DN - OE 囊胚期的卵裂球移植到野生型宿主胚胎中。令人惊喜的是，大多数移植的 DN - OE 卵裂球都能像正常的 PGC 一样迁移到性腺嵴，最终到达性腺的比例高达 100%，远远高于对照组的 48%。这表明，DN - OE 卵裂球能够变成 PGC 样细胞，也就是 iPGCs，并成功迁移到生殖嵴。

iPGCs 可分化为功能性卵子和精子

研究人员使用 sox9b - DsRed/olvas - EGFP 转基因青鳉作为 DN - OE 供体胚胎，进一步确认 iPGCs 是否能够产生功能性的卵子和精子。他们将不同数量的 DN - OE 卵裂球移植到通过 CRISPR - Cas13d 系统敲低 dnd1 和 nanos3 的生殖细胞缺陷宿主胚胎中。结果显示，当移植少于 20 个卵裂球时，对照组没有产生生殖系嵌合体，而 DN - OE 供体细胞组有 89% 的胚胎发育成了生殖系嵌合体；当移植多于 50 个卵裂球时，对照组和 DN - OE 供体细胞组的生殖系嵌合体比例分别为 45% 和 100%。这充分说明，DN - OE 卵裂球形成生殖系嵌合体的效率明显高于对照组。而且，由 DN - OE 卵裂球产生的生殖系嵌合体发育成的成年鱼，无论是雌性还是雄性，都具有生育能力，其 F1 代子代也都表现出相应的荧光信号，这表明 iPGCs 确实能够发育成功能性的卵子和精子。不过，研究人员也发现，部分 XX 型的 DN - OE 嵌合体出现了性别逆转现象，这背后的原因还有待进一步探究。

dnd1 和 nanos3 协同产生 iPGCs

研究人员通过向 16 细胞期胚胎的单个卵裂球中分别注射 dnd1 或 nanos3 的 mRNA，以及同时注射两者的 mRNA，来评估它们产生 iPGC 的能力。结果发现，单独过表达 dnd1 或 nanos3 时，只有少数胚胎能够恢复少量生殖细胞；而同时注射 dnd1 和 nanos3 的 mRNA 时，93% 的胚胎都能产生大量的 iPGCs，且这些 iPGCs 强烈表达 zygotic olvas - EGFP。进一步的原位杂交分析表明，GP 基因 vasa、piwil1、dazl 和 tdrd1 以及趋化因子受体 cxcr4b 在 iPGCs 中均有表达，这说明 iPGCs 具有与正常 PGC 相似的基因表达模式。此外，研究人员还发现，斑马鱼的 dnd1 和 nanos3 也能在青鳉中诱导产生 iPGCs，并且这些 iPGCs 同样能够迁移到性腺，这表明 dnd1 和 nanos3 协同产生 iPGCs 的机制在硬骨鱼类中可能是保守的。

iPGCs 可用于基因组编辑

研究人员尝试利用 CRISPR - Cas9 系统，通过同源定向修复（HDR）技术，在青鳉中实现内源性 VASA 蛋白的荧光标记，也就是生成 vasa:EGFP 敲入（KI）青鳉。他们先向 1 细胞期胚胎中注射相关的 KI 溶液，但并没有获得 EGFP 阳性的胚胎。随后，他们将 iPGC 诱导技术与基因组编辑技术相结合，先敲低内源性的 dnd1 和 nanos3，再向 16 细胞期胚胎的一个卵裂球中注射 dnd1、nanos3 mRNA 以及其他相关物质。最终，成功获得了 EGFP 阳性的胚胎，并且这些胚胎的 iPGCs 中 EGFP 信号与内源性 VASA 蛋白共定位，还稳定地传递到了下一代。这一结果表明，iPGC 诱导技术与 CRISPR - Cas9 系统的结合，能够有效地实现精确和稳定的蛋白质标记转基因鱼的生成。

在讨论部分，研究人员指出，他们发现 dnd1 和 nanos3 是 GP 中协同参与鱼类 PGC 形成的关键元素，这为理解脊椎动物生殖细胞生物学提供了重要的线索。iPGCs 在配子发生起始和性腺雌性化方面，与野生型 PGC 存在差异，这或许有助于我们深入了解生殖细胞发育的调控机制。在应用方面，将 CRISPR - Cas13d 系统介导的 dnd1 和 nanos3 敲低用于制备无菌宿主，以及 DN - OE 用于供体制备，能够显著提高鱼类生殖系替换技术的效率，这对于濒危物种的保护和优良品种的繁育具有重要意义。此外，研究还发现，在 16 细胞期向胚胎的中心卵裂球注射 KI 溶液，能够提高 HDR 介导的 KI 效率，这为基因组编辑技术在鱼类中的应用提供了新的思路。不过，该研究也存在一些局限性，比如 dnd1 和 nanos3 协同作用的具体分子机制尚未明确，它们的下游靶标也有待进一步探索。

总的来说，这项研究成果意义重大。它不仅揭示了 dnd1 和 nanos3 在鱼类 PGC 形成中的关键作用，还为生殖细胞发育机制的研究提供了新的方向。同时，研究中建立的 iPGC 诱导和基因组编辑技术相结合的方法，为基因编辑工具的开发和应用开辟了新的道路，有望在未来的生物医学研究和生物技术领域发挥重要作用，助力我们更好地理解生命的奥秘，推动相关领域的发展和进步。