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为解决 ALMTs 激活机制不明等问题，研究人员开展 AtALMT9 激活机制的研究。他们解析了其结构，揭示离子传导及脂质调控机制。该研究为理解 ALMT 家族功能提供关键线索，强烈推荐科研读者阅读。
在植物的奇妙世界里，气孔（植物叶、茎等部位表皮上的小孔，是植物与外界进行气体交换的通道 ）的开合就像植物的 “呼吸开关”，对植物适应陆地环境起着至关重要的作用。气孔的开合控制着植物叶片与大气之间的水分和气体交换，这一过程直接关系到植物对各种环境压力的应对能力。而在这个过程中，液泡（植物细胞中一种充满液体的囊泡结构，具有储存物质、调节渗透压等功能 ）体积的变化起着关键作用，它就像是植物细胞的 “仓库” 和 “调节器”，通过运输渗透物质来改变自身的体积，从而影响气孔的开合。
在众多参与这一过程的 “小助手” 中，铝激活苹果酸转运蛋白（ALMT）家族的离子通道尤为重要。它们位于液泡膜上，在气孔开合过程中负责运输氯离子和苹果酸等物质。这个家族十分庞大，而且功能多样，参与了植物生长发育的许多过程，比如铝抗性、矿物质吸收、花粉管生长、果实酸度调节等。在模式植物拟南芥中，ALMT 家族有 14 个成员，它们各自分工，有着不同的功能特性。
然而，ALMT 家族的 “工作机制” 仍有许多谜团等待解开。比如，液泡型 ALMTs 呈现出电压依赖性和缓慢的激活动力学，这种独特的性质暗示着可能存在尚未被发现的调节元件参与其中。此外，虽然之前的研究已经揭示了一些 ALMTs 的结构和功能，但对于它们在分子水平上的激活机制，特别是脂质与 ALMTs 之间的相互作用，我们仍然知之甚少。而且，非机械敏感通道的孔隙中脂质的募集情况也还是个未解之谜。
为了揭开这些神秘的面纱，来自 [第一作者单位] 的研究人员在《Nature Communications》期刊上发表了一篇题为 “Structural insights into the activation mechanism of the vacuolar anion channel AtALMT9” 的论文。他们通过深入研究，得出了一系列重要结论，为我们理解 ALMT 家族的功能提供了新的视角，这对于揭示植物适应环境的分子机制有着重要意义。
在这项研究中，研究人员使用了多种关键技术方法。利用冷冻电镜技术（cryo-EM，一种能够在接近生理状态下观察生物大分子结构的高分辨率显微镜技术 ），他们获得了 AtALMT9 在不同脂质结合状态下的结构；运用分子动力学（MD）模拟，探究了 AtALMT9 在不同离子条件下的导电状态；借助质谱分析，检测了与 AtALMT9 结合的脂质种类；通过电生理学方法，对 AtALMT9 及其突变体的功能进行了分析。这些技术相互配合，为研究 AtALMT9 的奥秘提供了有力的工具。
下面我们一起来看看他们都有哪些重要发现。
1. AtALMT9 多样的脂质结合状态
研究人员发现 AtALMT9 在电生理实验中，会产生一种由膜电位变化引起的电流，这种电流包含三个成分。为了搞清楚这种电流背后的结构基础，他们对 AtALMT9 进行了纯化，并收集了三个不同条件下的冷冻电镜数据集。通过分析这些数据集，他们发现 AtALMT9 以二聚体的形式存在，其拓扑结构与其他 ALMT 结构相似，而且每个 AtALMT9 原聚体都有两个侧向窗孔（类似小孔的结构 ），这些窗孔与离子传导孔相连。
更有趣的是，他们在孔隙和侧向窗孔中观察到了脂质的密度。通过进一步分类和分析，发现 AtALMT9 存在多种脂质结合状态，他们根据脂质的类型和位置，将这些状态分为固醇模拟物结合态、孔隙脂质结合态和仅外周脂质结合态三大类，总共包含九个结构类。这些不同的脂质结合状态就像是 AtALMT9 的不同 “装备”，可能影响着它的功能。
2. 仅外周脂质结合态的两种不同孔隙宽度
在仅外周脂质结合态中，研究人员发现了两种不同孔隙宽度的状态，分别命名为 N（窄）和 W（宽）。高分辨率的密度数据让他们能够清晰地看到这两种状态下的结构差异。在 N 状态下，孔隙呈现出不对称的脂质结合模式，溶剂密度仅出现在孔隙的入口和出口，反映出其狭窄的孔隙结构，不利于溶剂进入。而 W 状态则呈现出更开放的结构，孔隙中存在多个溶剂密度和三个苹果酸密度。
进一步研究发现，这两种状态下，一些关键残基（组成蛋白质的基本单位氨基酸的特定部分 ）的侧链定位不同，比如 R143 和 R200。这些残基的不同定位会影响孔隙的宽度，而且还与脂质的结合以及苹果酸的结合有关。通过对 N142 和 Y197 这两个残基进行突变实验，研究人员发现它们之间的相互作用对于维持 AtALMT9 的宽孔构象非常重要，这就像是一把 “钥匙”，控制着孔隙的开合状态。
3. 脂质和苹果酸的竞争性孔隙结合
研究人员还发现，在大多数情况下，AtALMT9 的孔隙被脂质堵塞，处于堵塞状态。在这些堵塞状态中，脂质的头部基团会与 R143 和 R200 等残基结合，占据苹果酸的结合位点，从而阻止苹果酸的结合。这表明脂质和苹果酸在孔隙中存在竞争关系，就像是两个 “竞争者”，争夺着孔隙中的 “位置”。
通过测量 TMD（跨膜结构域，蛋白质中跨越细胞膜的部分 ）二聚体的 Cα 根均方偏差（RMSD），研究人员发现不同的脂质结合状态对 AtALMT9 的 TMD 构象影响较小，而且脂质结合后 TMD 会保持宽孔状态。这说明脂质虽然会堵塞孔隙，但并不会让 AtALMT9 的结构发生太大改变，这其中的机制十分巧妙。
4. 电压和苹果酸依赖的非堵塞孔隙传导
研究人员通过分析孔隙半径发现，N 状态的孔隙存在两个狭窄的收缩部位，太窄以至于水分子或氯离子都难以通过。而 W 状态下，由于苹果酸的结合和外周脂质的存在，孔隙的收缩部位变宽，使得氯离子和苹果酸能够通过。
为了进一步探究 AtALMT9 的导电状态，研究人员进行了分子动力学模拟。他们发现，在零膜电位下，N 和 W 状态都没有离子通量。但在细胞质负膜电位下，两种状态的构象会转变为导电状态，而且苹果酸浓度的变化会影响离子的传导方式。通过对 R143、R200 和 R226 等残基进行突变实验，研究人员证实了这些残基在离子渗透过程中起着重要作用，它们就像是离子通过孔隙的 “引导者”。
5. 脂质通过侧向亲水窗孔堵塞传导孔隙
由于大多数 AtALMT9 在基础状态下被脂质堵塞，研究人员推测通道激活时，孔隙脂质需要进出孔隙。但脂质头部基团穿过疏水膜和窗孔在热力学上是不利的，因此他们分析了 TMD 表面的亲水性。结果发现，ALMT9 存在三个亲水表面，分别位于膜侧、窗孔内部和孔隙入口。
通过序列比对，他们发现这些亲水表面在进化上有一定的保守性，而且制备 T147A 和 T205A 突变体进行电生理学分析后发现，这两个残基对于维持 AtALMT9 的功能非常重要。粗粒化模拟也进一步证实了脂质可能通过亲水窗孔进行迁移，这为解释脂质如何调节 AtALMT9 的活性提供了新的线索。
综合这些研究结果，研究人员不仅揭示了 AtALMT9 的孔隙残基在激活过程中的构象变化，还发现 R143、R200、R226 以及 N142-Y197 对是 AtALMT9 激活的关键构象决定因素。MD 模拟结果与实验数据相符，展示了离子通过孔隙的运输过程，为理解 AtALMT9 的电压依赖性变化提供了重要依据。
此外，研究还表明脂质和固醇可能在体内调节 AtALMT9 的活性，孔隙脂质的堵塞和移除可能参与了 ALMT9 离子运输活性的调节，这一机制在进化上可能具有保守性。研究人员还提出了 AtALMT9 的潜在激活机制，为后续研究提供了重要的理论框架。
然而，这项研究也存在一些局限性。比如，异源表达系统的膜与植物液泡膜存在差异，可能会忽略一些植物特异性脂质；脂质结合状态的不确定性以及洗涤剂的使用可能会对实验结果产生影响。尽管如此，该研究为我们理解 ALMT 家族的功能提供了重要的基础，有助于进一步探究植物离子通道的奥秘，对于揭示植物适应环境的分子机制有着重要的推动作用，也为未来的植物生理学研究指明了新的方向。
