惊！AIF3 剪接变体竟成线粒体 “破坏者”，揭秘其引发线粒体疾病与脑发育缺陷的神秘机制

为解决 AIF 异常剪接变体在患者中的作用及机制问题，美国得克萨斯大学西南医学中心的研究人员研究 AIF3 剪接变体。结果发现其破坏线粒体功能和脑发育，NDI1 可部分恢复。该研究为线粒体疾病和脑发育研究提供新视角，值得一读。

　　

在神秘的生命科学领域，线粒体疾病就像一群隐藏在身体深处的 “捣乱分子”，它们是罕见的遗传疾病，却能对身体各个器官的正常功能发起 “攻击”，导致发育异常、神经问题和代谢紊乱等一系列麻烦事儿。在这场身体内部的 “战争” 中，有一个名为凋亡诱导因子（Apoptosis-Inducing Factor，AIF）的 “角色” 引起了科学家们的高度关注。

研究发现，AIF 的基因突变与线粒体疾病有着紧密的联系。到目前为止，科学家们已经发现至少 26 种不同的 AIF 突变，这些突变会引发各种线粒体相关疾病，像线粒体脑肌病、轴突感觉运动神经病等。在动物实验中，携带 Aifm1 基因内含子 1 原病毒插入突变的丑角小鼠（Harlequin mice），随着年龄增长，小脑和视网膜会出现神经退行性变。而且，从果蝇、线虫到小鼠等各种模式生物的基因敲除研究也表明，AIF 对于维持线粒体呼吸链复合物的稳定性和氧化磷酸化（Oxidative Phosphorylation，OXPHOS）至关重要。

不过，现有的研究还存在不少谜团。一方面，之前的动物模型研究并不能完全揭示 AIF 异常变体或突变引发线粒体疾病的机制，因为这些模型无法同时模拟 AIF 缺失和异常 AIF 变体或突变的情况。另一方面，AIF 在结构和功能上也存在诸多争议。AIF 由 X 染色体上的 AIFM1 基因编码，在各种组织和器官中广泛存在。它最初在细胞质中合成，随后进入线粒体并加工成熟。但由于其特殊的定位，研究人员很难获取全长成熟的 AIF 进行研究，以往大多使用截短的 “可溶性” AIF 蛋白，这就导致了研究结果不一致，甚至可能产生误解。例如，关于 AIF 在线粒体呼吸和氧化还原稳态中的具体作用，科学界一直争论不休，AIF 到底是自由基清除剂还是活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）产生者，尚无定论。此外，虽然之前已经发现了几种 AIF 剪接异构体，但对于病理条件下诱导产生的 AIF3 剪接异构体，人们对其了解还十分有限。

为了揭开这些谜团，深入了解 AIF 在正常生理和病理状态下的作用，研究人员踏上了探索之旅。来自美国得克萨斯大学西南医学中心（UT Southwestern Medical Center）的研究人员在《Nature Communications》期刊上发表了一篇名为 “AIF3 splicing disrupts mitochondrial function and brain development by impairing NAD (P) H and glutathione reductase activities” 的论文。他们通过一系列研究，得出了重要结论，为我们理解线粒体疾病和 AIF 的作用机制打开了新的大门。

在这项研究中，研究人员使用了多种技术方法来探寻答案。他们通过 PCR（聚合酶链式反应）检测 AIF3 mRNA 的表达情况；运用 RNA 原位杂交技术，观察 AIF3 在细胞中的表达定位；采用免疫印迹和免疫沉淀等技术，分析蛋白质的表达和相互作用；利用透射电子显微镜，观察线粒体的超微结构；借助 Seahorse 分析技术，评估线粒体的呼吸功能；还运用代谢组学分析，研究细胞内代谢物的变化。这些技术就像研究人员手中的 “秘密武器”，帮助他们一步步揭开 AIF3 的神秘面纱。

接下来，让我们看看研究人员都有哪些惊人的发现吧。

1. 遗传变异和突变是导致 AIF3 剪接的潜在风险因素：研究人员对患有线粒体疾病的儿童的死后额叶皮质组织进行研究，发现 AIF3 剪接在这些患者中显著增强。通过对 15 个人类死后大脑组织的筛查，他们发现约 50% 的人存在一种缺失外显子 2 的 AIF（ΔE2AIF）mRNA 剪接变体，而且在患有线粒体疾病的儿童中，这种变体的频率更高。进一步分析 141,456 个人类样本的全外显子测序数据，发现 AIFM1 基因的外显子 3 具有很高的基因突变率。通过 CRISPR/Cas9 技术对 AIFM1 基因的外显子 2 和 3 进行编辑，研究人员证实了外显子 2 和 3 的遗传或体细胞突变会增加 AIF3 剪接的风险。此外，对患有线粒体疾病的儿童大脑组织进行 5’ RACE 分析，发现了多种 AIF3 和 ΔE2AIF 剪接异构体，以及一些 AIF3L 异构体，这表明病理条件下的遗传或体细胞突变会增加 AIF3 (L) 剪接的风险。
2. AIF3 剪接导致线粒体异常和小鼠大脑发育缺陷：研究人员通过亚细胞分级分离和免疫染色等实验，发现内源性剪接的 AIF3 蛋白主要定位于线粒体的内膜和外膜，部分会错误定位到线粒体基质。在 AIF3 剪接的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）和皮质神经元中，线粒体出现异常形态，如围绕细胞核聚集呈甜甜圈状，线粒体嵴结构紊乱。而且，AIF3 剪接会导致小鼠胚胎和出生后大脑发育缺陷，如大脑皮层变薄、海马体发育受损等。这些结果表明 AIF3 剪接会破坏线粒体结构，进而影响大脑发育。
3. AIF3 剪接损害线粒体功能和呼吸链复合物的活性：通过 TMRE 染色、ATP 检测、氧消耗率（OCR）测量等实验，研究人员发现 AIF3 剪接会降低线粒体膜电位，减少线粒体 ATP 生成，抑制线粒体呼吸。进一步研究发现，AIF3 剪接会降低线粒体呼吸链复合物 I、III、IV 和 V 的活性，导致线粒体功能障碍。这一系列研究揭示了 AIF3 剪接影响线粒体功能的具体机制。
4. AIF3 剪接导致线粒体复合物解体和 ROS 水平升高：研究人员通过免疫印迹分析发现，AIF3 剪接会特异性地导致线粒体复合物解体，降低复合物 I、III、IV 中一些亚基的蛋白水平。通过线粒体 DNA 质量检测和 RNA - seq 分析，排除了转录调控对线粒体复合物亚基稳定性的影响。此外，研究发现 AIF3 剪接会增加 ROS 水平，且 AIF3 剪接不仅会增加 ROS 的产生，还会抑制 ROS 的清除，这为解释 AIF3 剪接导致线粒体功能障碍提供了新的视角。
5. AIF3 剪接损害 AIF 的 NADPH 和 NADH 脱氢酶活性：通过体外生化实验和细胞代谢组学分析，研究人员发现 AIF3 缺乏 NADH/NADPH 脱氢酶活性，AIF3 剪接会破坏 NAD?/NADH 和 NADP?/NADPH 的稳态。进一步研究发现，AIF3 结构更紧密、更稳定，这可能导致其 NAD (P) H 脱氢酶活性降低。分子对接模型显示，AIF3 的结构变化会阻碍 NAD (P) H 与活性结合位点的结合，从而影响其脱氢酶活性。
6. AIF3 剪接消除 AIF 的 GR 活性，阻断 GSH 再生和 ROS 清除：研究人员发现 AIF 具有之前未被认识的谷胱甘肽还原酶（Glutathione Reductase，GR）活性，而 AIF3 剪接会减弱这种活性。通过对 ROS 清除途径中关键酶的研究，发现 AIF3 剪接主要影响 GSH 系统，导致 ROS 清除失败。结构分析表明 AIF 和 GR 的结构存在相似性，进一步实验证实了 AIF 的 GR 活性及其在细胞内的作用，为理解 AIF 在氧化还原稳态中的作用提供了新的依据。
7. 通过 NDI1 恢复 NADH 稳态可降低 ROS 水平，保护 AIF3 剪接小鼠大脑中的神经元：研究人员发现酵母 NADH 脱氢酶 NDI1 可以部分恢复 AIF3 剪接细胞和小鼠大脑中的线粒体复合物 I 活性，降低 ROS 水平，保护皮质神经元。通过体外实验和体内实验，研究人员证实了 NDI1 的作用机制，为治疗 AIF3 剪接相关的线粒体疾病和大脑发育缺陷提供了潜在的治疗靶点。

总的来说，这项研究揭示了 AIF 在维持细胞谷胱甘肽氧化还原稳态和线粒体功能方面的重要作用。AIF 不仅是一种哺乳动物 NAD (P) H 脱氢酶，还具有 GR 活性，通过双重调节机制保障线粒体的完整性和功能，清除 ROS。而 AIFM1 基因外显子 2 和 3 的突变和变异会增加 AIF3 剪接的频率，AIF3 剪接会破坏线粒体结构和功能，导致大脑发育缺陷。同时，研究人员还发现酵母 NDI1 可以部分恢复 AIF3 剪接小鼠的线粒体功能，保护神经元。这些发现为我们理解线粒体疾病的发病机制提供了新的理论依据，也为开发治疗线粒体疾病和相关神经发育障碍的新方法奠定了基础。

不过，研究人员也清楚地认识到，这项研究还存在一些局限性。比如，AIF3 失去或获得的具体功能还不清楚，AIF 维持线粒体复合物稳定性和组装的分子机制有待进一步研究，线粒体功能障碍与神经退行性变和神经元细胞死亡之间的关系也需要更深入的探索，AIF3 剪接的详细机制同样需要进一步挖掘。但这也为后续的研究指明了方向，相信在科学家们的不断努力下，我们对线粒体疾病和 AIF 的认识会越来越深入，未来也可能会找到更有效的治疗方法，为那些受线粒体疾病困扰的人们带来新的希望。