Lectin-PAINT：解锁细胞糖萼奥秘，开启单细胞糖型分析新征程

为解决现有细胞糖萼研究技术的局限，研究人员开展 Lectin-PAINT 技术相关研究。结果显示该技术能在单细胞和单分子水平多重成像分析糖萼。推荐阅读，它将带你了解这一技术如何助力糖萼研究，为相关领域提供新思路。

　　

在微观的细胞世界里，有一层神秘的 “外衣”—— 细胞糖萼（glycocalyx），它围绕在细胞膜周围，对细胞的正常运作起着关键作用。这层 “外衣” 由多糖和与蛋白质（糖蛋白）或脂质（糖脂）结合的糖类组成，就像细胞的独特 “指纹”，不仅能帮助细胞之间相互识别、交流，在细胞的生长、发育以及免疫反应等众多生命活动中，都扮演着不可或缺的角色。比如说，在细胞的免疫反应过程中，细胞糖萼上的糖类就像是传递信息的 “小使者”，帮助免疫细胞识别外来的病原体，从而启动免疫防御机制。

然而，一旦细胞糖萼的糖基化（glycosylation）过程出现异常，就会引发一系列严重的健康问题。像糖尿病、败血症、动脉粥样硬化、感染性疾病，甚至是让人谈之色变的癌症，都与它密切相关。以癌症为例，某些特定的糖类抗原，如唾液酸化路易斯抗原 X（sialyl Lewis，sLe），在胰腺癌、胆管癌、胃癌和结直肠癌中都大量存在，是重要的癌症标志物。

虽然细胞糖萼如此重要，但想要深入了解它却困难重重。细胞糖萼中聚糖的构建模块是十种单糖，它们通过糖苷键连接，形成了极其复杂的结构。而且，与有明确模板的蛋白质合成不同，聚糖的合成是在高尔基体中通过多种酶促反应完成的，这就导致了聚糖的组合方式多得数都数不清。再加上硫酸化、磷酸化、（O） - 乙酰化、甲基化和分支等修饰，使得细胞表面的糖类呈现出高度的时空异质性。

目前的研究技术在面对细胞糖萼的复杂性时，都存在着各自的短板。比如说，质谱（mass spectrometry）虽然能详细地分析聚糖的丰度和结构，但它需要复杂的样品制备过程，还得把细胞破坏掉，这样一来，就没办法了解聚糖在细胞中的空间分布和细胞间的差异了。而凝集素微阵列（lectin microarrays）呢，能提供细胞表面聚糖的一些信息，可有时候也得把细胞裂解，而且它没办法展示完整的聚糖结构。就算是能进行活细胞分析的技术，也或多或少存在着问题，有的缺乏时空信息，有的需要对细胞进行修饰，可能会改变细胞原本的状态。所以，开发一种新的研究方法，来更全面、准确地研究细胞糖萼，就显得尤为重要了。

为了攻克这些难题，来自 作者[第一作者单位] 的研究人员在《Nature Communications Biology》期刊上发表了一篇名为 “Lectin-PAINT enables multiplexed single-cell glycotyping” 的论文。他们成功开发出一种名为 “Lectin-PAINT” 的超分辨率成像方法，能够在单细胞和单分子水平上对细胞糖萼进行多重活细胞成像，这为研究细胞糖萼的奥秘提供了全新的视角。

研究人员在这项研究中运用了多个关键技术方法。首先是基于点积累纳米形貌成像（point accumulation in nanoscale topography，PAINT）技术，利用凝集素与糖类之间可逆的弱相互作用来实现超分辨率成像。其次，构建了包含 8 种植物来源凝集素的文库，这些凝集素能特异性地结合不同的糖类，以此来识别和研究多种聚糖。另外，结合微流控技术，实现了对细胞的多色成像分析；还运用了单细胞追踪（single particle tracking，SPT）和主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）等数据分析方法，对细胞的糖型进行分类和特征提取 。

下面来详细看看研究结果。

1. 方法学和凝集素文库：研究人员精心挑选了 8 种植物来源的凝集素，组成了一个凝集素文库。像金耳凝集素（aleuria aurantia lectin，AAL）、西非单叶豆凝集素 II（griffonia simplicifolia-II lectin，GSL）等，这些凝集素各有 “分工”，它们对不同的糖基化修饰有选择性，能覆盖生理学和疾病相关的重要糖类，而且对特定糖苷键的选择性也不同。利用这些凝集素的低亲和力，研究人员进行了 Lectin-PAINT 超分辨率显微镜成像。在这个过程中，荧光标记的凝集素就像一个个 “小侦探”，在细胞培养基里自由扩散，一旦它们遇到能结合的聚糖，就会暂时 “停留” 在细胞表面，发出荧光信号。通过对这些信号的分析，研究人员就能收集到细胞糖基化的多种定量信息，比如结合事件的密度和空间分布、凝集素 - 糖复合物的移动性以及结合动力学等。一次测量就能得到 44 个定量特征，用完整的 8 种凝集素文库对单个细胞进行测量，就能得到 352 个特征，这些特征就像是细胞糖型的 “密码”。
2. 细胞捕获和 Lectin-PAINT 概念验证：为了让这个方法能适用于更多的细胞类型，研究人员尝试了三种细胞固定方法：固定贴壁法、活细胞贴壁法和活细胞捕获法。固定贴壁法能获得高分辨率的图像，清晰地看到糖的分布模式，但可能会改变细胞的糖基化谱；活细胞贴壁法可以研究聚糖在细胞膜上的扩散情况，不过对于一些细胞来说，信号噪声比低，成像面积也有限；活细胞捕获法通过在玻片上创建抗污聚乙二醇化层，并结合捕获抗体，成功解决了悬浮细胞的成像问题，还提高了信号噪声比。研究人员用小麦胚芽凝集素（wheat germ agglutinin，WGA） - ATTO643 探针在三种条件下进行了 1 - 色 PAINT 成像，结果表明在这三种条件下 Lectin-PAINT 都能有效地发挥作用，而且不同条件下得到的信息各有特点。
3. 不同细胞系的糖型分析：研究人员选择了四种不同的细胞系，包括 A431、A549、MDA - MB - 468 和 CHO - Lec2，用 8 种凝集素文库对它们进行研究。A549 和 MDA - MB - 468 是癌细胞系，有着异常高的唾液酸化水平；CHO - Lec2 是糖基化突变细胞系，几乎没有唾液酸化，当作阴性对照；A431 则对唾液酸键有选择性。研究人员对每个细胞系的 40 个细胞进行成像，同时测量两种凝集素，收集了大量的单分子事件数据。通过分析这些数据，研究人员发现不同细胞系的糖型存在显著差异。比如说，A549 细胞的糖基化与其他细胞系不同，它的一些扩散参数，像轨迹位移、总移动距离和平均方向性变化率等，都比其他细胞系要高；CHO - Lec2 在某些参数上也有独特的表现。通过雷达图等方式展示这些数据，能更直观地看出不同细胞系糖型的差异，就像是给每个细胞系的糖型绘制了一幅独特的 “画像”。
4. 单细胞糖基化研究：研究人员利用 Lectin-PAINT 非破坏性和空间分辨的特点，深入研究了单细胞水平上的糖基化异质性。他们重点研究了唾液酸的 α2,3 和 α2,6 键，这两种键分别与癌症的转移和侵袭深度有关。通过比较不同细胞系中 MAL（识别 α2,6 键）和 SNA（识别 α2,3 键）的结合事件比例，发现不同细胞系的唾液酸键比例差异很大，而且细胞群体中还存在着明显的宏观异质性，每个细胞的糖基化表达都不一样。同样，对岩藻糖基化模式的分析也得到了类似的结果。这表明通过 Lectin-PAINT，能够详细地研究单细胞水平上的糖基化特征，揭示细胞群体中的异质性。
5. 白血病细胞的自动糖型分析：为了充分发挥 Lectin-PAINT 对活细胞进行分类的潜力，研究人员开发了一套工作流程。先用微流控装置对捕获的细胞进行 8 - 色成像，再进行单细胞追踪和机器学习分析。他们选择了三种急性髓系白血病（acute myeloid leukaemia，AML）细胞系 HL - 60、Kasumi - 1 和 KG - 1 进行研究，这些细胞系的分类一直存在一些挑战。通过 Lectin-PAINT 对每个细胞系的 50 个细胞进行分析，研究人员发现不同细胞系的糖型存在明显差异。比如说，HL - 60 和 Kasumi - 1 虽然在形态学上分类相同，但它们的糖型却不一样；KG - 1 的大多数聚糖表达水平最高。与质谱和荧光激活细胞分选（Fluorescence Activated Cell Sorting，FACS）等技术比较后发现，Lectin-PAINT 能提供独特的信息，比如聚糖的动态变化。而且，通过主成分分析发现，即使排除了一些主要的区分参数，细胞系之间仍然能明显区分，这说明除了聚糖的表达水平，其移动性参数对细胞分类也非常重要。

从研究结论和讨论部分可以看出，Lectin-PAINT 为细胞糖基化研究带来了新的曙光。它有着许多令人瞩目的优点，比如能提供强大而离散的单分子荧光信号，高灵敏度地研究单个聚糖的时空分布和移动性；可以直接对细胞的天然糖基化进行成像，不需要复杂的预处理；通过精心设计的探针文库，具有很强的通用性和可定制性；最重要的是，能在单细胞水平上获得细胞的糖型信息，为细胞分类提供了新的依据。

不过，就像任何新技术一样，Lectin-PAINT 也有一些需要改进的地方。它不是无标记的方法，依赖于凝集素的结合，所以对探针的质量要求很高。而且，植物凝集素会与多种聚糖结合，这给研究结果的分析带来了一定的复杂性。另外，多色糖型分析需要多激光照射和微流控的剪切应力，可能会对细胞造成压力，影响实验结果。

但这并不影响 Lectin-PAINT 的重要意义。它为细胞糖萼的研究提供了一个全新的视角，与其他研究方法，如质谱和 FACS，形成了很好的互补。未来，随着技术的不断完善，Lectin-PAINT 有望在基础研究领域，帮助科学家们更深入地了解聚糖 - 凝集素相互作用在免疫系统中的作用机制；在应用领域，它也可能为精确诊断疾病和开发新的治疗药物开辟新的道路，让我们在生命科学和医学健康领域迈出更坚实的步伐。