解锁结直肠癌治疗新密码：MLKL 抑制联合 HHT，开启抗癌新征程

为解决结直肠癌（CRC）治疗难题，研究人员开展 MLKL 与 HHT 联合治疗 CRC 的研究。结果发现二者联用可抑制 CRC 细胞自噬、触发 parthanatos 并抑制肿瘤生长。该研究为 CRC 治疗提供新方向，值得科研读者一读。

　　

在癌症的世界里，结直肠癌（Colorectal Cancer，CRC）是一个让人头疼的 “大反派”。你知道吗？大约 20% 的 CRC 患者在被诊断出来的时候，就已经出现了转移，而那些原本局部患病的患者，治疗后也有 40% 会出现转移。更糟糕的是，发生转移的 CRC 患者，五年生存率竟然还不到 20%！面对这样严峻的形势，科学家们一直在努力寻找新的治疗方法，希望能给患者带来新的希望。

在细胞的死亡机制中，有一种叫做坏死性凋亡（necroptosis）的过程，它是由一种叫 MLKL（mixed lineage kinase domain - like protein，混合谱系激酶结构域样蛋白）的假激酶驱动的。正常情况下，MLKL 激活后会聚合，在细胞膜上形成小孔，从而杀死细胞。但奇怪的是，有研究发现，用小分子 MLKL 抑制剂 necroptosis（NSA）处理，或者敲除 MLKL 基因，不仅没有促进 CRC 细胞死亡，反而降低了它们的存活率。这一现象引起了研究人员的极大兴趣，他们想知道，MLKL 的失活能不能成为治疗 CRC 的新方法呢？

为了揭开这个谜团，来自 [第一作者单位] 的研究人员进行了深入研究，并在《期刊原文名称》上发表了题为《论文原文标题》的论文。他们发现，MLKL 失活和一种治疗慢性粒细胞白血病的药物高三尖杉酯碱（homoharringtonine，HHT）联合使用，可以有效杀死 CRC 细胞，抑制它们在体内形成肿瘤。这一发现为 CRC 的治疗带来了新的曙光。

研究人员在研究过程中用到了好几种关键技术方法。比如，他们利用 CRISPR 技术对 MLKL 基因进行敲除，以此来研究 MLKL 失活后的影响；通过 RNA 干扰技术，降低某些基因的表达水平，观察细胞的变化；还用了肿瘤异种移植实验，把 CRC 细胞接种到小鼠体内，研究药物对肿瘤生长的抑制作用；此外，通过流式细胞术分析细胞周期和死亡情况，以及利用 western blotting 技术检测蛋白表达水平，这些技术就像是研究人员手中的 “魔法棒”，帮助他们一步步揭开了其中的奥秘。

下面我们来看看具体的研究结果。

HHT 增强 MLKL 失活导致的 CRC 细胞死亡

研究人员发现，RAS 基因的激活常常会驱动 CRC 的发生，它会让一种叫 ERK 的蛋白激酶活跃起来，从而促进 CRC 细胞的存活。为了弄清楚 ERK 抑制是否通过坏死性凋亡来杀死 CRC 细胞，研究人员用 ERK 抑制剂 SCH 772984 处理表达致癌 RAS 的 CRC 细胞 HCT116，同时加入 NSA，结果发现 NSA 并没有阻止 SCH 772984 诱导的细胞死亡，这说明坏死性凋亡抑制并不是 ERK 依赖的 CRC 细胞存活机制。

让人意外的是，MLKL 虽然通常会促进细胞死亡，但 NSA 却降低了 HCT116 细胞的克隆形成能力。研究人员进一步用 CRISPR/Cas9 技术构建了 MLKL 基因敲除的细胞系，发现 MLKL 缺陷型细胞的克隆形成能力明显低于正常细胞，这表明 MLKL 失活确实能降低 CRC 细胞的克隆存活能力。

既然 MLKL 失活对 CRC 细胞存活的影响有限，研究人员就开始寻找能增强这种效果的方法。他们测试了多种针对 CRC 促进机制的药物，结果发现这些药物都没有增强 MLKL 基因敲除导致的细胞死亡。然而，HHT 却不一样，它和 MLKL 基因敲除联合使用，能显著降低 DLD1 细胞的克隆存活能力和细胞总数，而且 HHT 和 MLKL 抑制剂 NSA 联合使用，对多种 CRC 细胞系（DLD1、HCT116、LS180 和 SW480）的克隆存活能力都有明显的抑制作用。这就像是找到了一把 “神奇的钥匙”，HHT 和 MLKL 失活联合起来，能更有效地 “锁住” CRC 细胞的生存之路。

NSA 和 HHT 联合降低 CRC 细胞在体内的致瘤性

研究人员发现，NSA 和 HHT 联合使用，能显著抑制 HCT116 细胞在免疫缺陷小鼠体内形成皮下肿瘤的能力。在这个过程中，研究人员还密切关注了小鼠的体重变化，这是评估药物毒性的一个重要指标。让人欣慰的是，无论是单独使用药物还是联合使用，小鼠都没有出现体重减轻的情况，也没有明显的身体异常。这表明这种联合治疗方法不仅有效，而且相对安全，不会对小鼠造成太大的伤害，就像是找到了一种既能打败敌人，又不会伤害自己人的 “秘密武器”。

MLKL 不会通过分泌可溶性因子或促进 TRAIL 受体降解来保护 CRC 细胞免于死亡

之前有研究提出，MLKL 可能会通过一些机制促进肿瘤细胞的存活，比如驱动乳腺癌细胞分泌促生存细胞因子，或者促进死亡受体 DR5 的溶酶体降解。但研究人员发现，在他们的实验中，这些机制并不适用于 CRC 细胞。用 MLKL 产生细胞的条件培养基处理 MLKL 缺陷型 DLD1 细胞，并没有让它们从 HHT 的作用中恢复；MLKL 缺失也没有上调 CRC 细胞中 DR5 和 DR4 的表达，这说明 MLKL 对 CRC 细胞的影响并不是通过这些机制实现的，就像是排除了一些错误的 “线索”，让研究人员更加明确了方向。

MLKL 失活和 HHT 联合通过抑制基础自噬杀死 CRC 细胞

自噬（autophagy）是细胞内的一种 “自我清理” 过程，对细胞的生存有着重要的调节作用。研究人员想知道，MLKL 失活和 HHT 联合是否会影响 CRC 细胞的基础自噬。他们通过检测自噬相关蛋白 LC3B 的脂化情况来判断自噬水平。结果发现，在没有巴弗洛霉素 A1（一种阻断自噬体与溶酶体融合的抑制剂）处理时，LC3B - II（脂化的 LC3B 形式）在细胞中很难检测到，而加入巴弗洛霉素 A1 后，LC3B - II 的水平明显上升，这说明细胞的基础自噬率很高，会导致 LC3B - II 的溶酶体降解，使得它难以被检测到。

进一步研究发现，MLKL 基因敲除、NSA 或 HHT 单独处理，都能显著下调巴弗洛霉素 A1 处理的 MLKL 表达型 DLD1 细胞中 LC3B - II 的水平，而且 MLKL 基因敲除或 NSA 与 HHT 联合使用，下调作用更明显。通过检测 GFP - LC3 的 puncta（斑点）形成情况也得到了类似的结果，这表明 MLKL 失活和 HHT 联合能降低 CRC 细胞的基础自噬。

为了验证自噬抑制是否是导致 CRC 细胞死亡的原因，研究人员用 HHT 处理 MLKL 基因敲除的细胞，同时加入一种由 HIV - 1 TAT 蛋白转导结构域和 Beclin - 1 蛋白片段组成的细胞渗透性肽（一种自噬诱导剂）。结果发现，这种肽几乎完全阻止了 MLKL 基因敲除对 HHT 处理的 DLD1 细胞生长的抑制作用，这说明 MLKL 失活和 HHT 联合抑制自噬是导致 CRC 细胞死亡的关键因素。此外，研究人员还发现，抑制自噬足以抑制 CRC 细胞的生长，这为后续的研究提供了重要的依据，就像是找到了 CRC 细胞死亡的 “开关”，而这个开关就是自噬抑制。

MLKL 失活使 CRC 细胞自噬依赖于 VPS37A

ESCRT 机制在细胞中起着重要作用，它包含多个蛋白复合物，能促进各种囊泡的形成，包括内体和自噬体。在坏死性凋亡过程中，MLKL 可以激活 ESCRT - I 和 III，修复受损的细胞膜，延缓细胞死亡。研究人员想知道 ESCRT - I 在他们观察到的现象中扮演着什么角色，于是研究了 VPS37A（ESCRT - I 复合物的关键成分）敲低前后，MLKL 表达型和 MLKL 基因敲除的 DLD1 细胞中 LC3B - II 的水平。结果发现，VPS37A 敲低对正常的 MLKL 表达型 DLD1 细胞的 LC3B 脂化没有影响，但却显著降低了 MLKL 基因敲除的 DLD1 细胞中 LC3B 的脂化水平，而且在 MLKL 缺陷且 HHT 处理的细胞中，VPS37A 无法促进 LC3B 的脂化。这表明 MLKL 失活降低了 CRC 细胞的自噬，并且使这种自噬变得依赖于 VPS37A，就像是给自噬加上了一个 “特殊条件”，只有在 VPS37A 存在的情况下，自噬才能正常进行，而 HHT 的加入又打破了这种平衡。

HHT 通过激活 p38MAPK 抑制 CRC 细胞的自噬

HHT 是一种核糖体抑制剂，它会引发一系列的细胞反应，其中包括激活 p38MAPK。p38MAPK 可以通过多种机制抑制自噬，比如磷酸化并使自噬刺激因子 ULK1、ATG5 和 ATG9 失活。研究人员发现，HHT 能上调 p38MAPK 的磷酸化水平，这表明 p38MAPK 被激活了。用 p38MAPK 的抑制剂 SB203580 处理 MLKL 基因敲除的 DLD1 细胞后，细胞中 LC3B - II 的水平恢复到了未处理细胞的水平，这说明 HHT 诱导的 p38MAPK 激活很可能介导了 HHT 对 MLKL 缺陷型 CRC 细胞自噬的抑制作用，就像是找到了 HHT 抑制自噬的 “幕后推手”，原来是 p38MAPK 在起作用。

MLKL 失活和 HHT 联合通过 parthanatos（一种程序性坏死形式）杀死 CRC 细胞

研究人员想知道 MLKL 失活和 HHT 联合处理会引发哪种细胞死亡形式。通过流式细胞术分析细胞周期，他们发现 MLKL 基因敲除和 HHT 联合使用，会增加具有亚二倍体亚 G1 DNA 含量的细胞群体，这表明细胞出现了染色体 DNA 断裂，可能是凋亡（apoptosis）或 parthanatos 等程序性细胞死亡的表现。

由于用 caspase（凋亡执行蛋白酶）抑制剂 zVAD - FMK 处理后，无论 MLKL 是否存在，都会导致大量染色体 DNA 降解，而且 caspase 抑制在多项研究中都被发现会引发非凋亡性细胞死亡，再结合 HHT 杀死细胞的能力强烈依赖于 MLKL 的存在，研究人员认为 HHT 处理和 MLKL 失活不太可能协同导致 CRC 细胞凋亡。

而 parthanatos 是由聚（ADP - 核糖）聚合酶 1（PARP1）的过度激活引发的程序性坏死。研究人员发现，PARP 抑制剂奥拉帕尼（olaparib）可以阻止 HHT 诱导的 MLKL 基因敲除的 DLD1 细胞中亚 G1 DNA 含量的形成，而且 HHT 会导致细胞中多种 PAR 聚合物的显著增加，这是 parthanatos 的一个特征，同时自噬诱导肽可以阻止 HHT 上调细胞中的 PAR 水平。这一系列结果表明，MLKL 失活和 HHT 联合抑制 CRC 细胞的自噬，而这种自噬抑制会触发 parthanatos，就像是找到了细胞死亡的 “新路径”，原来自噬抑制和 parthanatos 之间有着这样紧密的联系。

低 MLKL mRNA 表达意味着 CRC 患者生存率增加

研究人员还利用 GEPIA 这个工具，分析了 MLKL 表达与 CRC 患者生存率之间的关系。他们发现，CRC 患者中 MLKL mRNA 水平降低与生存率增加相关，这与之前的一些研究结果一致，即 CRC 和食管癌中磷酸化（即激活）的 MLKL 蛋白水平降低与患者生存率增加相关。这进一步支持了一个观点，那就是 CRC 细胞中活性 MLKL 表达水平越低，细胞的活力就越低，癌症的致命性就越低，患者的生存时间就越长，就像是找到了一个可以预测患者预后的 “信号”，MLKL 的表达水平或许能帮助医生更好地了解患者的病情。

综合以上研究结果，研究人员得出结论：药理学或遗传学上的 MLKL 失活与 HHT 联合使用，可以阻断 CRC 细胞的基础自噬，触发 parthanatos，而且 MLKL 抑制剂和 HHT 在体内能协同抑制 CRC 细胞的致瘤性。这意味着 MLKL 抑制联合 HHT 治疗是一种潜在的治疗 CRC 的新方法。

这项研究意义重大。首先，它揭示了 MLKL 在 CRC 细胞中的新功能，即它不仅在坏死性凋亡中起作用，还通过支持基础自噬促进 CRC 细胞的存活，这让我们对 MLKL 的认识更加全面。其次，研究发现了 MLKL 失活和 HHT 联合治疗 CRC 的潜在方法，为未来的临床治疗提供了新的思路。虽然目前还需要进一步研究来确定这种联合治疗在人体中的安全性和有效性，但它无疑为 CRC 患者带来了新的希望。而且，研究还提出 PARP1 可能是预测 CRC 对这种联合治疗敏感性的生物标志物，如果能进一步验证，将有助于医生为患者制定更精准的治疗方案。可以说，这项研究为攻克 CRC 这个难题迈出了重要的一步，让我们离战胜癌症又近了一些。