CRISPR 纳米颗粒靶向 GDF15：重塑胶质母细胞瘤免疫微环境，开启抗癌新征程

为解决胶质母细胞瘤（GBM）免疫治疗疗效有限的问题，研究人员开展针对 GBM 免疫关键调节因子的研究。结果发现敲除 GDF15 可改善免疫微环境，增强 ICB 疗效。该研究为 GBM 治疗提供新思路，强烈推荐科研读者阅读。

　　

在医学领域，胶质瘤是常见的原发性脑肿瘤，其中胶质母细胞瘤（GBM）最为凶险，约占胶质瘤病例的一半。目前针对 GBM 的标准治疗手段，像手术、放疗、药物治疗（常用替莫唑胺）以及肿瘤治疗电场（TTFields），虽然有一定作用，但对提高患者生存率的效果并不显著。这主要是因为肿瘤在关键器官侵袭性生长，阻碍了局部治疗；血脑屏障（BBB）保护着肿瘤细胞，使其难以被药物作用；癌细胞还对诱导细胞死亡具有抗性，并且缺乏针对性的药物 。同时，GBM 独特的免疫微环境也给免疫治疗带来了巨大挑战。

免疫疗法在肝癌、胃癌等多种实体肿瘤治疗中取得了显著成效，可对于 GBM 患者来说，却收效甚微。这是由于 GBM 肿瘤内的 “冷” 免疫微环境，缺乏通用的肿瘤特异性抗原靶点，而且免疫抑制性微环境阻碍了 T 细胞的渗透和激活。因此，开发新的治疗方法来对抗肿瘤的免疫反应，解决肿瘤对免疫治疗的抗性，成为了 GBM 治疗领域亟待解决的问题。

为了攻克这些难题，研究人员进行了深入探索。作者[第一作者单位] 的研究人员在《Journal of Nanobiotechnology》期刊上发表了题为 “CRISPR/Cas9 nanoparticles targeting GDF15 reshape the tumor immune microenvironment and enhance glioblastoma immunotherapy” 的论文。他们发现生长分化因子 - 15（GDF15）在 GBM 的免疫逃逸中起着关键作用，通过基因编辑技术抑制 GDF15 的表达，可以重塑肿瘤免疫微环境，增强免疫检查点阻断（ICB）疗法的效果，为 GBM 的治疗提供了新的方向和策略。这一研究成果意义重大，有望为 GBM 患者带来新的希望。

在这项研究中，研究人员运用了多种关键技术方法。他们构建了小鼠单导向 RNA（sgRNA）文库，并利用体内 CRISPR 敲除（KO）筛选技术，在同基因 GBM 小鼠模型中寻找关键的免疫调节基因。同时，合成了对肿瘤微环境（TME）有响应的纳米颗粒 ANP_SS（Cas9/sgRNA），用于 GDF15 基因编辑治疗，并通过多种检测技术，如单细胞质谱流式细胞术（CyTOF）、T7 核酸内切酶 I（T7E1）切割试验、下一代测序（NGS）等，来评估纳米颗粒的性能、基因编辑效率以及治疗效果 。

下面我们来详细看看研究结果：

1. 体内 CRISPR 筛选确定 GDF15 是免疫逃逸的关键驱动因素：研究人员使用小鼠慢病毒 CRISPR - Cas9 敲除（MusCK）文库，将其转导到表达荧光素酶的 GL261 细胞中，然后将这些肿瘤细胞移植到不同类型小鼠（C57BL/6 小鼠、免疫缺陷的 Rag1^?/?小鼠以及接受 PD - 1 阻断治疗的 C57BL/6J 小鼠）的大脑中，建立原位 GBM 模型。14 天后，对小鼠肿瘤进行高通量 sgRNA 文库测序。结果发现，T 细胞缺陷的 Rag1^?/?小鼠肿瘤最大，而接受抗 PD - 1 抗体治疗的免疫健全小鼠肿瘤最小。通过分析不同组的 CRISPR/Cas9 敲除筛选结果，发现 GDF15、SIK2 和 CPLX2 三个基因与胶质瘤的免疫反应相关。进一步通过多个公共数据库分析以及免疫组化（IHC）分析发现，GDF15 表达水平与患者预后密切相关，高表达 GDF15 的患者预后较差，且 GDF15 与 CD8⁺T 细胞浸润呈负相关 。
2. GDF15 敲除促进 M1 样巨噬细胞极化和 T 细胞激活：研究人员用来自 MusCK 文库的三种 sgRNAs 分别敲除 GL261 细胞系中的 GDF15。在体外实验中，GDF15 对肿瘤细胞的增殖和凋亡没有明显影响，但在免疫缺陷小鼠（Rag1^?/?）体内，敲除 GDF15 也未对肿瘤生长产生显著影响。然而，在正常同基因小鼠（C57BL/6）体内，敲除 GDF15 却显著抑制了肿瘤生长，延长了小鼠寿命。通过单细胞质谱流式细胞术（CyTOF）分析发现，敲除 GDF15 后，肿瘤内 CD8⁺效应 T 细胞和 M1 巨噬细胞数量增加，CD8⁺耗竭 T 细胞和 M2 巨噬细胞数量减少。此外，GDF15 敲除还增加了 CD8⁺CD69⁺T 细胞的比例，降低了 T 细胞耗竭标记物（如 PD1 和 TIM3）的表达，同时改变了巨噬细胞相关标记物的表达水平 。
3. 用于 GDF15 基因编辑治疗的 TME 响应性纳米颗粒的合成与表征：为了抑制肿瘤细胞中 GDF15 的表达，研究人员构建了负载 Cas9 和靶向 GDF15 的 sgRNA 的纳米颗粒 ANP_SS（Cas9/sgGDF15）。这种纳米颗粒通过原位自由基聚合技术制备，表面修饰有 Angiopep - 2，能够特异性结合血脑屏障内皮细胞和 GBM 肿瘤细胞表面的低密度脂蛋白受体（LRP - 1），促进纳米颗粒穿透血脑屏障并靶向肿瘤细胞。动态光散射（DLS）、透射电子显微镜（TEM）等检测表明，ANP_SS（Cas9/sgGDF15）纳米颗粒大小合适、结构稳定，在细胞内还原环境中能快速降解并释放 Cas9/sgGDF15。T7E1 切割试验和 Sanger 测序证明，该纳米颗粒能够在 GL261 细胞中实现精确的 GDF15 基因编辑。此外，ANP_SS（Cas9/sgGDF15）纳米颗粒具有良好的稳定性、内体逃逸能力和肿瘤靶向能力 。
4. ANP_SS（Cas9/sgGDF15）在原位 GBM 模型中的疗效评估：研究人员建立原位 GBM 小鼠模型，将小鼠随机分为不同治疗组，分别接受生理盐水、ANP_SS（Cas9/sgNC）或 ANP_SS（Cas9/sgGDF15）静脉注射。结果显示，接受 ANP_SS（Cas9/sgGDF15）治疗的小鼠肿瘤生长明显受到抑制，生物发光信号强度显著降低，中位生存时间显著延长。对肿瘤组织的分析表明，ANP_SS（Cas9/sgGDF15）治疗的基因编辑效率高，能显著降低 GDF15 蛋白表达，促进肿瘤细胞凋亡，减少细胞增殖，同时增加肿瘤内细胞毒性 T 淋巴细胞数量，减少 M2 样肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）浸润，增加 M1 样 TAMs 浸润 。
5. ANP_SS（Cas9/sgGDF15）在自发 GBM 模型中的体内抗肿瘤活性：在自发 GBM 小鼠模型中，研究人员同样验证了 ANP_SS（Cas9/sgGDF15）的抗肿瘤效果。与原位 GBM 模型结果相似，ANP_SS（Cas9/sgGDF15）治疗抑制了肿瘤生长，提高了小鼠的中位生存时间，降低了 GDF15 蛋白表达，促进了肿瘤细胞凋亡，减少了细胞增殖，改变了肿瘤微环境中免疫细胞的组成，增加了 T 细胞浸润和细胞毒性 。
6. ANP_SS（Cas9/sgGDF15）增强 PD - 1 阻断疗法的疗效：研究发现，靶向 GDF15 的 sgRNAs 在 α - PD - 1 治疗组中显著减少，这表明 GDF15 缺失可能增加 GBM 对 α - PD - 1 疗法的敏感性。为了验证这一点，研究人员对 GL261 荷瘤小鼠进行不同处理，结果显示，ANP_SS（Cas9/sgGDF15）与 α - PD - 1 联合治疗的效果优于单一治疗，显著抑制了肿瘤生长，延长了小鼠中位生存时间，增加了肿瘤内 M1 样 TAMs 和 GZMB⁺CD8⁺T 细胞的数量 。
7. ANP_SS（Cas9/sgGDF15）具有良好的安全性：研究人员对 ANP_SS（Cas9/sgGDF15）的安全性进行了评估。在对多种健康细胞的增殖实验中，未发现该纳米颗粒对细胞生长有显著影响。通过下一代测序（NGS）分析发现，在肿瘤组织以及大脑、心脏、肝脏和肾脏等器官中，ANP_SS（Cas9/sgGDF15）的脱靶效应极低，突变频率均低于 0.5%。对健康小鼠的免疫反应和毒性评估显示，ANP_SS（Cas9/sgGDF15）对肾脏和肝脏功能影响极小，且能防止肿瘤引起的体重减轻 。

研究结论和讨论部分指出，GBM 的肿瘤微环境抑制了免疫反应，降低了免疫检查点阻断疗法的疗效。该研究通过体内 CRISPR 筛选，首次系统地确定了 GBM 免疫微环境中的免疫调节因子 GDF15，证实了它是免疫逃逸的关键驱动因素。通过基因编辑技术抑制 GDF15 的表达，可以重塑肿瘤微环境，改善免疫抑制状态，增强 GBM 对 ICB 疗法的敏感性，使肿瘤出现完全或部分消退，延长患者生存时间。与传统的单克隆抗体治疗相比，基因编辑技术具有更好的靶向性、特异性和长期有效性。研究人员开发的非病毒 CRISPR - Cas9 递送系统 ANP_SS（Cas9/sgRNA），能够有效封装和保护 Cas9 蛋白和 sgRNA，实现精确的基因编辑，为 GBM 和其他肿瘤的治疗提供了新的策略和方法。这一研究成果为 GBM 的治疗带来了新的曙光，有望在未来的临床治疗中发挥重要作用，帮助更多的 GBM 患者战胜疾病。