靶向纳米平台：开启肝癌基因编辑与化疗协同治疗新时代

为解决肝癌治疗难题及 CRISPR/Cas9 系统递送问题，作者[第一作者单位] 研究人员开展生长抑素受体靶向纳米平台用于肝癌协同治疗研究。结果显示该平台效果良好。推荐科研读者阅读，以了解肝癌治疗新策略与纳米技术应用新进展。

　　

在医学领域，肝癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）一直是个让人头疼的 “大反派”。它是原发性肝癌中最常见的类型，也是导致癌症相关死亡的主要原因之一。很多肝癌患者在被诊断出来的时候，病情已经发展到了晚期。目前，像手术、化疗、质子束治疗、化疗栓塞和靶向药物治疗这些方法，效果都不太理想，只能让患者的生存期稍微延长一点，就像是给病情发展踩了个 “急刹车”，但车还是会往前滑一段距离。

为了找到更好的治疗方法，科学家们绞尽脑汁。这时候，CRISPR/Cas9 技术走进了大家的视野。它就像是一把神奇的 “基因剪刀”，可以精准地对基因进行编辑，在癌症治疗方面展现出了巨大的潜力。比如，它可以对致癌基因进行靶向编辑，直接阻断癌细胞的发展路径，还能编辑免疫细胞，增强它们对癌细胞的识别和杀伤能力，甚至能和传统疗法一起使用，发挥协同作用。

然而，这把 “基因剪刀” 在使用过程中也遇到了不少麻烦。就像一个没有导航的旅行者，它缺乏精准的靶向性，在运输过程中也不太稳定，很容易 “迷路”，导致治疗效果大打折扣。而且，现有的非病毒递送策略在运输 Cas9 核糖核蛋白（RNP）时，面临着高细胞毒性、体内稳定性差、粒径大、缺乏特异性肿瘤和细胞靶向能力等一系列问题，这些问题就像一道道 “关卡”，限制了 CRISPR/Cas9 技术在体内的应用。

在这样的背景下，研究人员决心要攻克这些难题。他们来自 作者[第一作者单位]，在《Journal of Nanobiotechnology》期刊上发表了题为 “A somatostatin receptor-targeted polymeric nanoplatform for CRISPR/Cas9 delivery and synergistic treatment of hepatocellular carcinoma” 的论文。他们成功开发出了一种生长抑素受体靶向的聚合物纳米平台，这个平台就像是一个 “智能快递员”，可以把 PD-L1 靶向的 CRISPR/Cas9 系统精准地送到癌细胞那里，实现对肝癌的协同治疗。这一成果为肝癌治疗带来了新的希望，也为基因编辑和化疗的联合应用开辟了新的道路。

为了开展这项研究，研究人员用到了几个关键的技术方法。首先是聚合物合成技术，他们合成了油酸修饰的聚乙烯亚胺（PEI-OA）和亚油酸功能化聚乙二醇 - 奥曲肽（LNA-PEG-OCT）；然后利用纳米颗粒制备和表征技术，制备出了不同类型的纳米颗粒，并对其进行了一系列的表征分析；还有细胞和动物实验技术，通过细胞实验和动物模型实验，来验证纳米平台的效果 。

下面我们来看看具体的研究结果。

1. 聚合物的合成与纳米颗粒的表征：研究人员通过将 OA 与 PEI 连接，成功合成了 PEI-OA，又通过迈克尔加成反应合成了 LNA-PEG-OCT。通过¹H-NMR 等技术对合成的聚合物进行了验证。他们制备了不同类型的纳米颗粒，像正电荷纳米颗粒（NPs）、负电荷纳米颗粒（CS/NPs）和靶向纳米颗粒（OCT/CS/NPs）。透射电镜结果显示，NPs 和 OCT/CS/NPs 呈均匀球形，而且 OCT/CS/NPs 表面多了一层膜。OCT/CS/NPs 的粒径明显大于 NPs，zeta 电位也不同。通过动态光散射（DLS）实验发现，NPs 和 OCT/CS/NPs 在 48 小时内都很稳定，在血液中与胎牛血清相互作用时，也能保持一致的电荷和粒径，形成蛋白冠的倾向很小。此外，OCT/CS/NPs 的溶血活性很低，安全性较高，而且具有一定的缓释效果，对 RNP 的包封能力也很强。
2. Cas9 RNP 的内吞和内切酶切割活性：研究人员用近红外荧光染料 DiD 代替紫杉醇（PTX），增强型绿色荧光蛋白和 Cas9 的融合蛋白（EGFP-Cas9）代替 Cas9 蛋白，通过共聚焦显微镜观察发现，OCT/CS/NPs 能将更多的 EGFP-Cas9 和 DiD 输送到细胞内和细胞核周围，说明它的协同双靶向作用有助于将治疗物质高效地输送到细胞核。通过流式细胞术检测，证实了 OCT/CS/NPs 可以同时包裹化疗药物和蛋白质。利用绿色荧光探针标记溶酶体，通过共聚焦显微镜观察发现，PTX + RNP-OCT/CS/NPs 可以保护 Cas9 蛋白不被溶酶体消化，实现溶酶体逃逸。研究人员还构建了靶向 PD-L1 的 sgRNA（sgPD-L1），通过 PCR 扩增、转录和琼脂糖凝胶电泳等实验，验证了其对 PD-L1 基因的靶向切割能力。在 HepG2 细胞中，PTX + RNP-OCT/CS/NPs 对 PD-L1 基因的编辑效率达到了 55.8%，在稳定表达绿色荧光蛋白的 293T 细胞（GFP-293T）中，RNP-OCT/CS/NPs 也成功编辑了 GFP 基因。
3. PTX + RNP-OCT/CS/NPs 在 HepG2 细胞中的药效学表征：通过蛋白质免疫印迹法（western blot）检测发现，PTX + RNP-NPs 和 PTX + RNP-OCT/CS/NPs 处理 HepG2 细胞 48 小时后，细胞中 PD-L1 的表达明显降低，说明 RNP 成功转染到细胞内并有效降低了 PD-L1 基因的表达。通过 MTT 实验评估纳米颗粒对 HepG2 细胞（高表达 SSTR2）和 293T 细胞（低表达 SSTR2）的细胞毒性，结果显示，PTX + RNP-OCT/CS/NPs 对 HepG2 细胞具有很强的细胞毒性，在 PTX 浓度为 15 μg/mL 时，能杀死近 90% 的 HepG2 细胞，而对 293T 细胞毒性较低。伤口愈合实验和细胞迁移实验表明，PTX + RNP-OCT/CS/NPs 能显著抑制 HepG2 细胞的迁移能力。通过 Annexin V-FITC/PI 染色和流式细胞术分析细胞凋亡情况，发现 PTX + RNP-OCT/CS/NPs 处理的细胞凋亡或坏死率高达 87.83%，说明它能促进细胞凋亡。
4. OCT/CS/NPs 在体内的靶向能力：研究人员用 DiD 代替 PTX，FITC 标记的牛血清白蛋白（FITC-BSA）代替 Cas9 蛋白，通过尾静脉注射到小鼠体内，观察纳米颗粒的体内分布情况。结果发现，OCT/CS/NPs 在小鼠肝脏中大量积累，肿瘤组织中靶向纳米颗粒（DiD + FITC-BSA-OCT/CS/NPs）的荧光强度比其他类型的纳米颗粒和游离药物溶液都要高很多，说明它具有很强的肝靶向性。对肝脏组织进行切片和免疫荧光共定位分析发现，OCT/CS/NPs 和 CS/NPs 能靶向高表达 CD44 的肝细胞，进一步证实了其靶向能力。
5. PTX + RNP-OCT/CS/NPs 在荷瘤小鼠中的治疗效果：研究人员在 HepG2 荷瘤小鼠模型中验证了 PTX 和 CRISPR/Cas9 联合治疗的效果。当肿瘤体积达到 50 mm³时，分别给小鼠静脉注射 PBS、PTX-Sol、PTX + RNP-NPs、PTX + RNP-OCT/CS/NPs。结果显示，PTX + RNP-OCT/CS/NPs 治疗组的肿瘤体积明显小于 PTX + RNP-NPs 治疗组，说明它的抑瘤效果更好。在治疗过程中，小鼠的体重没有明显变化，说明 PTX + RNP-OCT/CS/NPs 安全性和生物相容性良好。对肿瘤组织进行 TUNEL 染色、Ki67 免疫荧光染色、免疫组化分析等实验发现，PTX + RNP-OCT/CS/NPs 能促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖，降低 PD-L1 蛋白表达，提高 Cas9 表达，增强基因编辑效率，而且没有明显的脱靶效应。此外，它还能逆转肿瘤微环境中的免疫抑制，诱导 T 细胞介导的免疫反应，抑制肿瘤血管生成。
6. 安全性评价：通过对小鼠进行血液生化检查，检测碱性磷酸酶（ALP）、天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）和 γ- 谷氨酰转移酶（γ-GT）的水平，结果显示治疗组和对照组之间没有明显差异，说明 PTX + RNP-OCT/CS/NPs 的肝毒性可以忽略不计。对小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏等主要器官进行 H&E 染色，也发现药物处理组和对照组之间没有明显差异，进一步证明了其安全性。

研究人员成功设计并制备了一种可以同时递送 PTX 和 CRISPR/Cas9 RNP 的纳米颗粒药物递送系统。这个纳米平台就像一个 “超级战士”，集多种优势于一身，它粒径小、体内外稳定性高、对 HepG2 细胞的细胞毒性强、具有良好的肝靶向性，在肝癌小鼠模型中治疗效果显著，而且对正常组织的毒性很低。通过将 Cas9 RNP 高效递送到 HepG2 细胞的细胞核中，纳米平台使 PD-L1 基因发生突变，降低了 PD-L1 蛋白的表达，激活了 T 细胞，增强了抗肿瘤免疫反应。这一研究成果为肝癌的联合治疗带来了新的希望，也为其他疾病的治疗提供了一种新的思路和方法，让我们在攻克癌症的道路上又迈出了坚实的一步。相信在未来，随着研究的不断深入，这种纳米平台有望为更多的患者带来福音。