创新组合拳：Doehlert 设计与化学计量学联手优化神经递质检测，解锁科研新高度

为解决神经递质分析方法的优化问题，法国研究人员开展 Doehlert 设计结合化学计量学工具优化 HPLC 洗脱神经递质及代谢物的研究，得出优化条件和低检测限结果，对神经科学研究意义重大，值得一读。

　　

在科学研究的广阔领域中，实验设计就像是一把神奇的钥匙，能打开优化各种流程的大门，在农业、化学等诸多领域发挥着关键作用。在分析化学这个分支里，优化实验条件对于准确分析化合物来说至关重要。而 Doehlert 实验设计，凭借着用较少实验就能探索复杂实验空间的优势，备受科研人员的青睐。

在神经科学研究领域，准确测量神经递质（是在神经元、肌细胞或感受器间的化学突触中充当信使作用的特殊化学物质）的水平意义重大，它能帮助我们深入了解各种生理和认知过程。比如说，多巴胺（DA）与帕金森病的发生发展密切相关，血清素（5 - HT）影响着人们的情绪和睡眠。高效液相色谱 - 电化学检测法（HPLC - ECD）是常用的神经递质检测方法，但传统的实验条件往往不够理想，难以同时满足快速、高效、准确分离和检测神经递质及其代谢物的要求。而且，在处理像脑内微透析这样复杂的样品时，由于样品中神经递质和代谢物的含量极低，传统方法的局限性就更加明显了。所以，科研人员迫切需要一种新的方法来优化神经递质分析过程。

为了解决这些问题，来自法国图卢兹动物认知研究中心（Centre de recherches sur la Cognition Animale，CRCA）和图卢兹第三大学综合生物学中心（Centre de Biologie Intégrative，CBI）的 Camille Rosier、Bruno P. Guiard、Guillaume Gotti 等研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在了《Heliyon》期刊上，论文题目是《Application of Doehlert design combined with chemometrics tools: Example of the optimization of the elution of neurotransmitters and metabolites by HPLC》 。通过一系列的实验和分析，他们成功找到了优化神经递质及其代谢物洗脱和分离的方法，这一成果对于神经科学研究有着重要的意义。

在这项研究中，研究人员主要运用了三种关键的技术方法：

• Doehlert 实验设计：这种设计选取了 5 个影响洗脱液组成的参数，通过特定的计算方式确定实验值，能够用较少的实验次数全面地探索实验空间。
• 化学计量学分析：借助 R 和 R Studio 软件以及 mixOmics、ggplot2、MASS 等软件包，进行 Pearson 相关性计算和偏最小二乘法判别分析（PLS - DA），以此探究实验变量与神经递质浓度之间的关系，了解化合物的色谱行为。
• 检测限和定量限的确定：依据信噪比分别为 3 和 10 来确定检测限和定量限，同时构建不同化合物的校准曲线，确保检测的准确性。

下面，让我们一起看看他们的研究都有哪些重要发现：

Pearson 相关性分析

研究人员首先对影响流动相组成的多个参数，如甲醇（MeOH）和乙腈（ACN）在流动相中的百分比、pH 值、十二烷基硫酸钠（SDS）和柠檬酸的浓度，与色谱系统的压力、极性指数等参数进行了 Pearson 相关性分析。结果发现，极性指数的变化和流动相的组成密切相关，ACN 和 MeOH 的比例会影响它的大小。而系统压力则主要受 MeOH 比例的影响，因为 MeOH 的粘度比 ACN 高。让人意外的是，SDS 和柠檬酸对化合物洗脱的影响比较小，但在生物基质中，它们对防止凝血或影响质子化化合物的洗脱还是有作用的。

在众多的相关性中，最显著的是流动相 pH 值与平均理论塔板数（衡量色谱柱分离效率的一个重要指标，理论塔板数越高，色谱柱的分离效率越好）之间的关系。pH 值越低，也就是酸性越强，平均理论塔板数越高，柱效也就越高。不过，酸性过强又会影响色谱柱的稳定性，所以需要找到一个合适的 pH 值平衡点。此外，化合物的洗脱时间和溶剂极性指数成正比，极性指数还会影响峰不对称性。压力和 pH 值的增加也会使峰不对称性增加，这就意味着在实验中需要综合考虑这些因素，选择合适的参数来实现更好的分离效果。

PLS - DA 分析

为了更详细地了解所有目标化合物的色谱行为，研究人员又进行了 PLS - DA 分析。从分析结果来看，流动相的 pH 值对化合物的洗脱有着明显的影响，尤其是对 L - 多巴（L - DOPA）。对于去甲肾上腺素（NE）、肾上腺素（E）、5 - HT、褪黑素（MT）和 DA 这些化合物，pH 值的影响趋势相似。但像 3,4 - 二羟基苯乙酸（DOPAC）、高香草酸（HVA）和 5 - 羟基吲哚 - 3 - 乙酸（5 - HIAA）这些保留时间较短的化合物，受 pH 值变化的影响就比较小。

在理论塔板数方面，MT、L - DOPA、NE、E、DA 和 5 - HT 高度依赖 pH 值，而 5 - HIAA、DOPAC 和 HVA 则受其影响较小。对于 5 - HIAA 和 DOPAC 来说，较低的极性指数反而能提高分离效率。在峰不对称性上，L - DOPA、NE、E、DA、5 - HT 和 MT 在 pH 值和（或）压力增加时，峰不对称性会增加；而 HVA、5 - HIAA 和 DOPAC 对这种影响不太敏感，增加极性指数还能降低它们的峰不对称性。

优化条件

综合前面的研究结果，研究人员确定了能够有效、快速且分离良好地洗脱目标化合物的优化条件。在溶剂选择上，优先使用较多的 ACN 而不是 MeOH，这样可以降低极性指数，同时保持相对较低的压力。他们发现，极性指数接近 11.5、流动相 pH 值接近 2（磷酸浓度为 ）时比较合适，SDS 和柠檬酸的浓度分别控制在和左右。

为了进一步优化条件，研究人员还测试了多种的混合物。最终发现，使用（11.25/3.25/85.5；v/v/v）作为流动相，pH 值接近 1.65 时，能达到最佳效果。此时，洗脱时间接近 20 分钟，与脑内微透析实验的采样时间相匹配；柱效最佳，平均理论塔板数接近 8000；峰不对称性也最低，约为 1.23。从优化条件下的色谱图中可以清晰地看到，各种化合物都能得到很好的分离。

检测限和定量限

在优化了化合物的洗脱条件后，研究人员计算了检测限和定量限。结果显示，所有化合物的检测限和定量限都接近纳摩尔级别。这意味着该方法能够对生物样品，特别是通过脑内微透析探针连续灌注的人工脑脊液中的神经递质进行非常精细的定量分析。与以往的 HPLC - ECD 研究相比，这些数值更低或者相近，这表明新方法在检测灵敏度上有了很大的提升。虽然与质谱检测相比，该方法还存在一定的局限性，但在实际应用中，已经能够满足很多神经科学研究的需求。

研究人员通过将 Doehlert 实验设计与化学计量学分析（如 PLS - DA 和 Pearson 相关性分析）相结合，成功地优化了神经递质及其代谢物的洗脱条件。这种优化方法不仅实现了短洗脱时间、高柱效和低峰不对称性，还降低了化合物的定量限，提高了检测的准确性和灵敏度。

这一研究成果为神经科学研究提供了更高效、更准确的神经递质分析方法，有助于科学家们更深入地了解神经递质在生理和认知过程中的作用机制。而且，这种洗脱优化方案并不局限于神经递质分析，还可以推广到其他化学分析领域，帮助科研人员理解色谱参数对化合物物理化学行为的影响，为相关领域的研究提供了新的思路和方法。可以说，这项研究在化学分析和神经科学领域都有着重要的意义，为后续的研究工作奠定了坚实的基础。