揭秘结核杆菌 “逃逸术”：ESAT-6 如何借纤维化破坏吞噬体助力感染？

为解决Mycobacterium tuberculosis（Mtb）的 ESAT-6 介导吞噬体膜破坏机制不明的问题，印度国家科学教育与研究学院等机构的研究人员展开研究，发现 ESAT-6 经聚合作用使吞噬体样小室重塑和囊泡化。该成果为理解 Mtb 致病机制及开发新疗法提供依据，值得科研人员一读。

　　

在微观的细胞世界里，一场看不见的战争时刻都在上演。结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）作为结核病的 “罪魁祸首”，为了在宿主细胞中 “安营扎寨”、肆意繁殖，会使出各种 “狡猾” 的手段。它能够巧妙地调控吞噬体（一种由细胞膜包裹病原体形成的囊泡）的成熟过程，甚至打破吞噬体的束缚，成功逃到宿主细胞的细胞质中，从而躲避宿主免疫系统的攻击。

在这场细胞内的 “战争” 中，有一个关键角色 ——ESAT-6（6 kDa 早期分泌抗原靶蛋白，也叫 EsxA），它是 Mtb 分泌的一种具有高免疫原性的蛋白质，被认为在吞噬体破裂的过程中起着至关重要的作用。然而，这个关键角色究竟是如何发挥作用的，一直是困扰科学家们的谜题。尽管之前的研究对 ESAT-6 进行了不少探索，但关于它介导吞噬体膜破坏的具体机制，仍然存在许多疑问。例如，ESAT-6 与吞噬体膜相互作用的动态过程是怎样的？它又是如何引发吞噬体膜重塑和破裂的呢？这些问题就像一团团迷雾，笼罩着科研人员，让他们急切地想要揭开其中的奥秘。

为了弄清楚这些问题，来自印度国家科学教育与研究学院（National Institute of Science Education & Research）等机构的研究人员，展开了深入的研究。他们的研究成果发表在了《Cell Reports》杂志上，论文题目是 “Real-time visualization reveals Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 disrupts phagosome-like compartment via fibril-mediated vesiculation”。通过一系列实验，研究人员发现 ESAT-6 能够通过聚合作用，促使类似吞噬体的小室发生重塑和囊泡化（vesiculation），最终导致吞噬体破裂，帮助结核分枝杆菌成功逃脱。这一发现就像是在黑暗中点亮了一盏明灯，为我们理解结核分枝杆菌的致病机制提供了重要线索，也为开发新的抗结核策略带来了希望。

研究人员为了开展这项研究，用到了几个关键技术方法。他们利用体外重组技术，模拟细胞内环境，研究 ESAT-6 与类似吞噬体膜的相互作用；借助活细胞成像技术，实时观察 ESAT-6 在细胞内的动态行为；还运用数值模拟方法，从理论上分析 ESAT-6 聚合产生的力对膜形状的影响。这几种技术方法相互配合，就像给研究人员提供了多双 “眼睛”，帮助他们全方位地观察和分析 ESAT-6 的作用机制。

下面我们来具体看看他们的研究结果。

ESAT-6 通过浅插入诱导吞噬体样小室膜的管状变形

Mtb 会通过 ESX-1 分泌系统释放 ESAT-6，来阻碍吞噬体的成熟，进而实现自己 “逃离” 吞噬体的目的。研究人员为了弄清楚 ESAT-6 与吞噬体膜之间的关系，进行了一系列实验。他们首先通过色氨酸内在荧光法，测量 ESAT-6 与模拟吞噬体膜的结合亲和力。结果发现，ESAT-6 与膜的结合比较弱，解离常数（）约为 400 mM。接着，为了更直观地观察 ESAT-6 与膜相互作用的动态过程，他们将巨型单层囊泡（GUVs，模拟吞噬体）固定在表面，然后加入荧光标记的 ESAT-6。神奇的事情发生了，在加入 ESAT-6 后的 10 秒内，它就均匀地结合到了 GUVs 表面，紧接着，在 1 分钟内，GUVs 就发生了管状变形。研究人员还通过超分辨率成像技术发现，ESAT-6 是离散地结合在膜上，并且引起了膜曲率的变化。此外，他们利用深度敏感荧光淬灭探针研究 ESAT-6 在膜中的插入深度，发现 ESAT-6 并不会穿透整个脂质双分子层，而只是插入到与它相互作用的脂质层的酰基链 C5 位置。同时，ESAT-6 对磷脂酰胆碱（DOPC）头部基团有优先结合性，在不同的模拟吞噬体膜中，它在 DOPC 膜上的结合强度最高123。

ESAT-6 结合降低膜张力并使其更易压缩

研究人员接着探究了 ESAT-6 介导的膜重塑过程中，细胞膜张力会发生怎样的变化。由于吞噬体膜来源于细胞膜，他们用 ESAT-6 处理培养的 THP-1 分化巨噬细胞（一种免疫细胞），并使用膜张力传感器 Flipper-TR 来监测细胞膜的荧光寿命变化。结果发现，5 mM 的 ESAT-6 与巨噬细胞膜结合后，荧光寿命从 4.2 ns 下降到了 3.4 ns，这表明细胞膜张力显著降低。同样地，在模拟吞噬体膜的 GUVs 实验中，ESAT-6 与 GUVs 相互作用后，膜张力也明显下降。此外，研究人员还利用脂质单分子层膜研究了 ESAT-6 结合对膜压缩性的影响。他们发现，加入 ESAT-6 后，膜的表面压力增加，并且膜的压缩模量降低了 2 倍，这意味着膜变得更加容易变形45。

更高表面密度的 ESAT-6 诱导吞噬体膜出芽和囊泡化起始

虽然 ESAT-6 在吞噬体内的生理浓度还不清楚，但考虑到吞噬体的体积有限，其局部浓度可能较高。因此，研究人员使用了 1 - 20 mM 的 ESAT-6 浓度进行实验。他们用高浓度（20 mM）的 ESAT-6 处理模拟吞噬体膜的 GUVs，结果发现 ESAT-6 会诱导膜形成大的管状结构和芽，这些芽的曲率有正有负。而且，通过分析芽的大小分布，他们发现大多数芽的直径小于 3 mm，比母囊泡小很多。研究人员还推测，对于 2 mm 大小的吞噬体样小室，可能会形成更小的芽，这使得在细胞内很难观察和区分这些芽。另外，他们通过测量 ESAT-6 色氨酸残基的荧光寿命，发现随着时间的推移，局部极性增加，这可能与 ESAT-6 介导的膜重塑有关67。

ESAT-6 纤维化驱动吞噬体膜的囊泡化速率

许多细菌分泌蛋白都被猜测具有形成淀粉样纤维的倾向，ESAT-6 是否也有这样的特性呢？研究人员通过硫代黄素 T（ThT）荧光测定法研究 ESAT-6 的纤维化特性，发现 20 mM 的 ESAT-6 在吞噬体的酸性 pH 5.5 条件下，会迅速发生纤维化，并且在 24 h 左右达到平衡阶段。而在 pH 7.4 的环境中，ESAT-6 的纤维化速度则明显变慢。在有吞噬体膜界面存在的情况下，ESAT-6 的纤维化动力学也会显著减慢。此外，研究人员还在 THP-1 衍生的巨噬细胞中观察到了 ESAT-6 的纤维化现象。他们发现，巨噬细胞吞噬 ESAT-6 后，ESAT-6 在细胞内形成了纤维网络，并且随着时间的推移，吞噬体样小室的数量减少，这表明 ESAT-6 可能破坏了吞噬体膜，进入了细胞质。研究人员通过动态光散射实验发现，只有在高浓度（20 mM）的 ESAT-6 存在下，膜泡才会发生明显的裂变，形成更小的囊泡，这说明 ESAT-6 的纤维化对于芽的裂变至关重要，并且裂变的动力学取决于纤维化的速率，而纤维化速率又与蛋白质的浓度有关89。

ESAT-6 聚合的力量驱动吞噬体膜变形的形状转变

ESAT-6 的纤维化是如何引起膜变形和裂变的呢？研究人员利用数值模拟来探索这个问题。他们发现 ESAT-6 聚合形成的纤维会产生垂直和径向的力，这些力会改变膜的形状。在模拟过程中，他们通过调整垂直力和径向力的大小，观察膜的变化。结果发现，垂直力可以调节芽的大小，而径向力则控制芽的形状，促使形成收缩的颈部，这种特定的形状变化对于后续芽从颈部脱离的裂变过程非常关键。此外，研究人员还通过实验验证了这一理论。他们观察到 ESAT-6 的 N 端和 C 端突变体分别会减缓聚合和无法诱导聚合，相应地，这两种突变体导致的囊泡化过程也变慢甚至无法发生，这进一步证明了聚合作用力的重要性1011。

ESAT-6 纤维通过增加面积应变和诱导局部脂质分选促进膜裂变

为了验证数值模拟的结果，研究人员在等渗条件下对膜施加拉伸力，以排除渗透压的影响。他们通过微吸管吸取模拟吞噬体膜的 GUVs，施加 50 Pa 的负压来模拟 ESAT-6 聚合产生的力。在这个过程中，他们观察到加入未标记的 ESAT-6 后，微吸管吸取的 “舌头” 长度逐渐增加，并且在 “舌头” 中间出现了脂质相分离区域。通过分析，他们发现膜的面积应变在芽裂变前增加了 3 倍，而且膜张力在收缩点之前增加，之后则松弛并在囊泡化后达到平衡。此外，研究人员还发现，直接接触的分枝杆菌与吞噬体膜相互作用，也会导致膜的局部弯曲和脂质相分离，这表明物质交换可能是诱导相分离的一个潜在因素1213。

ESAT-6 诱导细胞凋亡和死亡

ESAT-6 在破坏吞噬体膜后，会对细胞产生什么影响呢？研究人员通过 Annexin V - 碘化丙啶（PI）染色发现，ESAT-6 会以浓度和时间依赖的方式诱导巨噬细胞发生凋亡。高分辨率电子显微镜显示，用 20 mM ESAT-6 处理巨噬细胞 24 h 后，细胞的细胞核解体，细胞膜破裂，细胞内容物释放出来。这说明 ESAT-6 在破坏吞噬体膜后，会进入细胞质并诱导细胞凋亡，最终导致细胞死亡1415。

综合以上研究结果，研究人员认为 ESAT-6 在吞噬体样小室内的纤维化可能会诱导膜的重塑和 / 或囊泡化，这会改变各种关键内体标记物的招募动力学，影响吞噬体的成熟过程。持续的囊泡化会降低膜的表面积与体积比，破坏细胞的修复机制，最终引发细胞凋亡。这些过程可能有助于结核分枝杆菌的逃逸和传播，促进感染的发生。

这项研究具有重要的意义。它首次揭示了 ESAT-6 在巨噬细胞吞噬体样小室内的纤维化现象，以及其通过纤维化介导吞噬体膜破坏的详细机制。这不仅为我们理解结核分枝杆菌的致病机制提供了新的视角，也为开发针对结核分枝杆菌感染的新型治疗策略提供了潜在的靶点。不过，研究也存在一些局限性，比如重建系统缺乏吞噬体膜叶的组成不对称性和运输所需的内体分选复合物（ESCRT）修复机制，而且内吞的 ESAT-6 浓度可能与生理浓度不同。但这并不影响该研究的价值，它就像一把钥匙，为后续更深入的研究打开了大门，相信在未来，科研人员会基于这些发现，取得更多对抗结核病的成果。